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本文运用细胞培养、RNA干扰、荧光染色成像分析、免疫组化、Western blotting等细胞学分子生物学技术和方法,以PC12细胞、SH-SY5Y细胞和原代神经元细胞为实验对象,系统研究了雷帕霉素在抗镉诱导神经细胞凋亡中的作用；雷帕霉素靶向mTORC1mTORC2通路抗镉诱导神经细胞凋亡机理；雷帕霉素抑制镉激活神经细胞JNK和Erk1/2通路抗凋亡机理；雷帕霉素抑制镉诱导神经细胞线粒体ROS介导JNK和Erk1/2通路激活机理；雷帕霉素靶向PTEN/PP2A信号网络抑制镉激活神经细胞Erk1/2通路抗凋亡机理；雷帕霉素抑制镉激活神经细胞JNK通路干预自噬机理。结果如下：1雷帕霉素抗镉诱导神经细胞凋亡采用PC12细胞、SH-SY5Y细胞和小鼠原代神经元在雷帕霉素(0.2μg/ml)预处理48 h后暴露10和20μM镉4h或24h。然后,观察细胞形态、台盼蓝染色计数活细胞数量、DAPI和TUNEL染色评估细胞凋亡表现,检测Caspase-3/7活性、Western blot分析细胞Caspase-3激活表现。结果显示,镉以浓度依赖的方式诱导神经细胞活性下降和形态改变,核浓缩和断裂细胞及TUNEL阳性细胞的数量增加,Cleaved-caspase-3蛋白表达及Caspase-3/7活性升高；雷帕霉素预处理能够明显削弱镉诱导的神经细胞活性下降和凋亡表现,阻滞镉诱导Caspase-3激活。提示：雷帕霉素具有明显防止镉诱导神经细胞凋亡性死亡作用。2雷帕霉素靶向mTORCl和1nTORC2通路抗镉诱导神经细胞凋亡以PC12细胞、SH-SY5Y细胞和/或小鼠原代神经元在单独雷帕霉素(0.2μg/ml)预处理48 h后、或再联合Akt抑制剂X预处理2h后暴露10和/或20μM镉4h或24 h；另用Ad-mTOR-T、Ad-mTOR-TE、Ad-dn-Akt、Ad-4EBP1-5A、 shRNA Raptor、shRNA Rictor、shRNA Raptor/Rictor、shRNA S6K1感染的PC12细胞和/或SH-SY5Y细胞在雷帕霉素预处理48 h后暴露20μM镉4h或24 h。然后,观察细胞形态、台盼蓝染色计数活细胞数量、DAPI染色评估细胞凋亡表现,并运用Western blot分析相关信号变化。结果显示,雷帕霉素阻滞镉诱导细胞Akt、S6K1和4E-BP1磷酸化；mTOR-T过表达抵抗雷帕霉素抑制镉诱导细胞凋亡,暗示雷帕霉素抗镉神经毒性是mTOR激酶活性依赖的；mTORC1和mTORC2涉及雷帕霉素抑制活性,这被在沉默Raptor、Rictor或Raptor/Rictor的细胞中呈现增强雷帕霉素抑制镉诱导细胞凋亡证据支持。此外,下调S6K1、异常表达4EBP1-5A、钝化Akt活性、或和Akt抑制剂X联合处理也强化雷帕霉素抗凋亡作用。提示：雷帕霉素靶向抑制镉诱导神经细胞mTORC1介导S6K1和4E-BP1通路及mTORC2介导Akt通路激活抗凋亡3雷帕霉素抑制镉激活神经细胞JNK和Erkl/2通路抗凋亡以PC12细胞、SH-SY5Y细胞和小鼠原代神经元在雷帕霉素(0.2μg/ml)预处理48 h后或联合.JNK抑制剂SP600125(20μM)、Erk1/2抑制剂U0126(5μM)或PD98059(10μM)预处理1 h,暴露10和20μM镉4h或24h。另用Ad-dn-c-Jun或shRNA Erk1/2感染的PC12细胞在雷帕霉素预处理48 h后暴露10或20μM镉4h或24h。然后,台盼蓝染色计数活细胞数量、DAPI染色评估细胞凋亡表现,并运用Western blot分析相关信号变化。结果显示,雷帕霉素预处理48 h明显抑制镉激活MAPKs级联包括JNK、Erk1/2和p38; JNK抑制剂SP600125或异位表达钝化c-Jun观察显示,镉诱导神经细胞凋亡明显抑制,联合雷帕霉素强化抑制效应；用U0126或PD98059特异性抑制Erk1/2或shRNA沉默Erkl/2显示,镉诱导神经细胞凋亡也被有力的逆转,同样联合雷帕霉素后这种抗凋亡保护效应被提高。提示：雷帕霉素抑制镉激活JNK和Erk1/2通路抗镉诱导神经细胞凋亡。4雷帕霉素抑制镉诱导神经细胞线粒体ROS介导JNK和Erkl/2通路激活采用PC12细胞和小鼠原代神经元在雷帕霉素(0.2μg/ml)预处理48 h后、或再联合TTFA(10 μM)、Antimycin A(50μM)、Mito-TEMPO(10μM)、SP600125 (20 μM)或U0126(5μM)预处理1h,然后暴露10和/或20μM镉4h或24h。另用Ad-dn-c-Jun或Ad-MKK1-K97M感染的PC12细胞和原代神经元在雷帕霉素预处理48 h后或Mito-TEMPO预处理1h后暴露20μM镉24 h。然后,利用ROS探针CM-H2DCFDA荧光成像细胞内ROS强度,运用Western blot分析相关信号变化。结果显示,雷帕霉素明显抑制镉诱导神经细胞ROS产生；通过TTFA和Mito-TEMPO降低镉诱导细胞ROS产生且雷帕霉素加强这种抑制效应,Antimycin A提高细胞ROS且抵抗雷帕霉素抑制ROS作用,提示雷帕霉素抑制镉诱导神经细胞线粒体ROS。Mito-TEMPO能够抑制并强化雷帕霉素抑制镉激活神经细胞JNK、Erk1/2和p38通路。通过SP600125和U0126抑制并增强雷帕霉素抑制、或增强Mito-TEMPO抑制镉诱导细胞ROS产生,表明镉诱导细胞线粒体ROS与激活的JNK和Erk1/2通路有密切关系,且调控JNK和Erk1/2也影响ROS产生。提示：雷帕霉素抑制镉诱导神经细胞线粒体ROS介导JNK和Erk1/2通路激活。5雷帕霉素靶向PTEN/PP2A信号网络抑制镉激活神经细胞Erkl/2通路抗凋亡采用PC12和SH-SY5Y细胞及原代神经元雷帕霉素(0.2μg/ml)预处理48 h后或联合Erk1/2抑制剂PD98059 (10 μM) 1h、PP2A抑制剂Okadaic acid (OA,100 nM)1 h及Akt抑制剂X (20μM) 2h预处理,再以镉(10和20μM)处理4h或24 h；采用腺病毒干扰钝化PP2A和Akt活性、或过表达PP2A和PTEN,以及异常表达抵抗雷帕霉素而有活性的mTOR (mTOR-T);或运用慢病毒干扰沉默mTOR;结合台盼蓝染色计数活细胞数量、DAPI染色评估细胞存活和凋亡表现,并通过Western blot分析相关信号变化。结果显示,雷帕霉素削弱镉增加的神经细胞磷酸化和去甲基化PP2A及降低的PTEN表达；利用PP2A抑制剂OA或异位表达钝化PP2A活性抵抗雷帕霉素抑制镉诱导神经细胞Erk1/2磷酸化和凋亡,而过表达PP2A加强雷帕霉素抑制活性；过表达PTEN或钝化Akt活性,或用Akt抑制剂X抑制Akt或PD98059抑制Erk1/2有力地增强雷帕霉素抑制镉诱导神经细胞Erk1/2磷酸化和凋亡；此外,过表达mTOR-T抵抗雷帕霉素削弱镉减低PP2A活性、降低PTEN表达和激活Erk1/2介导神经细胞凋亡,而沉默mTOR可以模拟雷帕霉素作用。提示：雷帕霉素通过靶向PP2A/PTEN信号网络抑制镉激活神经细胞Erk1/2通路抗凋亡。6雷帕霉素抑制镉激活神经细胞JNK通路干预自噬PC12细胞在雷帕霉素(0.2μg/ml)预处理6-48 h或48 h、或联合JNK抑制剂SP600125 (20 μM)预处理1h后,暴露10和20μM镉4 h。另用Ad-dn-c-Jun、Ad-PP5感染PC12细胞在雷帕霉素预处理48 h后暴露10μM镉4 h。然后,Western blot分析相关信号变化。结果显示,雷帕霉素预处理12-48 h明显抑制镉诱导细胞LC3-Ⅱ升高；JNK抑制剂SP600125或异位表达钝化c-Jun明显削弱镉诱导细胞LC3-Ⅱ增加,且强化雷帕霉素抑制效应；过表达PP5明显抑制镉诱导细胞JNK/c-Jun磷酸化和LC3-Ⅱ增加,但没有进一步强化雷帕霉素抑制镉诱导LC3-Ⅱ。提示：雷帕霉素能靶向抑制镉激活神经细胞JNK通路干预自噬发挥抗凋亡作用。