新生儿缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是指各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧，脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤。HIE最直接和最严重的后果是神经元死亡，保护神经元的正常存活，减少死亡是研究和解决神经系统疾病的最重要策略之一。TRPC（transient receptor potential canonical）是一种非特异性阳离子通道，它在体内，尤其在神经系统广泛表达，是调节细胞内钙离子稳态重要的离子通道，被认为最可能的钙库操纵性钙通道的分子基础。尽管研究发现它参与在缺血缺氧性脑损伤过程中的调节，但是对于TRPC通道的作用也存在争议。目前，普遍研究认为TRPC通过对细胞内阳离子的影响，在缺血缺氧性损伤中加重了细胞的损伤，但也有研究发现，TRPC在缺血缺氧过程中发挥保护性作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaian target of rapamycin, mTOR）是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR信号通路因处于细胞生长、增殖、存活调节的中心环节而备注关注。调控mTOR的上游信号分子主要有各种生长因子，Ca2+，氨基酸等。经上游信号分子激活后的mTOR通过磷酸化作用一方面活化下游的4E-BP1启动帽依赖性的蛋白质翻译起始，另一方面可以与核糖体S6蛋白激酶（p70S6K）一起促进蛋白翻译，同时还调节与生长存活相关的多条信号途径。目前对mTOR信号通路的研究主要集中在肿瘤的形成与发展过程中，尽管在缺血缺氧性脑损伤的作用也有报道，但是在HIE中的调控作用的相关报道甚少，特别是以TRPC通道作为切入点，结合mTOR信号通路来研究HIE的发病机制的相关报道。因此本课题以TRPC通道，Ca2+，mTOR信号通路为轴心线索，初步探讨TRPC通道在HIE中的作用及机制。方法1.离体培养新生Sprague-Dawley（SD）大鼠海马神经元和PC12细胞，给予糖氧剥夺(Oxygen-Glucose Deprivation，OGD)建立海马神经元及PC12细胞OGD模型。为了排除阻断TRPC通道本身对细胞正常功能影响以及OGD建模过程对细胞的损伤，我们设立了假缺氧模型（sham-OGD）组；又为了排除NMDA受体、AMPA受体及Ca2+通道对实验可能的影响，我们在阻断TRPC通道的同时，又再加入MNC（M：MK-80110μmol/L，为NMDA受体阻断剂； N：Nimodipine2μmol/L，为L-Ca2+通道阻断剂；C：CNQX10μmol/L，为AMPA受体阻断剂）。具体实验分组如下：a．Controlb．Sham-OGD+SKF96365(0，1，10，25μM)c．Sham-OGD+MNC+SKF96365(0，1，10，25μM)}d．OGD+SKF96365(0，1，10，25μM)e．OGD+MNC+SKF96365(0，1，10，25μM)}f．Vehicle并通过以下指标观察当不同程度阻断TRPC通道时，对OGD神经元、OGD-PC12细胞的影响，以确定TRPC通道在缺氧缺血伤害性刺激中对神经元的作用性质。a．MTT法检测细胞存活率b．LDH检测细胞膜完整性c．台盼蓝排斥实验检测细胞死亡率d．Hochest33342染色和流式细胞术检测细胞凋亡率。2.在阻断TRPC通道前后，a、激光共聚焦检测OGD海马神经元内钙离子浓度b．Western blot检测OGD海马神经元mTOR、4E-BP1、p70S6K蛋白以及蛋白的磷酸化表达以初步探讨TRPC通道对OGD神经元的作用机制3.数据经统计学统计软件(SPSS17.0)处理，组间比较用单因素方差分析(One-wayANOVA)检验。结果1．与对照组相比，OGD海马神经元与OGD-PC12细胞的损伤程度与SKF96365浓度呈正相关。其细胞存活率明显降低（p＜0.05）；细胞膜损伤，细胞死亡率与凋亡率均明显增加（p＜0.05）。2．阻断TRPC通道后，OGD神经元[Ca2+]i明显下调；p-mTOR、p-4E-BP1、p-p70S6K蛋白明显下调（p＜0.05）。结论本研究结果揭示了TRPC通道对缺血缺氧性脑损伤有保护性作用，其机制与TRPC通道经调控[Ca2+]i稳态来调控mTOR及其下游相关蛋白的磷酸化有关。结果也提示：TRPC通道可能是治疗脑损伤分子靶点，上调TRPC通道的表达，可能可以增强神经元抵抗伤害性刺激的能力，这对进一步研究TRPC通道在神经系统损伤中的作用，提供了新思路和理论基础。