研究表明香菇多糖(Lentinan,LTN)具有抗肿瘤、调节免疫力、降血糖、抗病毒及抗氧化等生物活性,尤其是抗肿瘤活性已成为当前研究热点。但目前关于香菇多糖抗肿瘤作用的机制尚未定论,多数学者认为多糖主要是通过增强机体的免疫功能而产生抗肿瘤作用。在前期研究中,本实验室已成功分离纯化了均一分子量的香菇多糖,体外实验发现其对多种肿瘤细胞的增殖均有一定的抑制作用,提示香菇多糖的抗肿瘤作用除了增强免疫活性外,还可能直接抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡。此外,许多研究已经证实香菇多糖能够增强机体的抗氧化能力。但这些研究主要集中于分子量分布较广的香菇粗多糖,且多为体外抗氧化实验,而有关不同分子量段的香菇多糖体内抗氧化活性研究还少有报道。因此本论文第一部分研究香菇多糖诱导肿瘤细胞凋亡的作用,并进一步通过研究其对肿瘤细胞骨架的影响,探讨香菇多糖诱导细胞凋亡的机制;第二部分研究不同分子量香菇多糖体内抗氧化活性,探讨香菇多糖分子量与其抗氧化活性的关系。　　第一部分香菇多糖抗肿瘤作用的机制研究　　在香菇多糖诱导鼠肝癌细胞H22凋亡的体外实验中,通过DAPI染色法观察细胞核形态学变化,AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率,PI单染色法检测细胞周期变化,JC-1染色法检测细胞内线粒体膜电位,DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧水平,Fluo-3/AM染色法检测细胞内钙离子浓度;在香菇多糖诱导鼠肝癌细胞H22凋亡的体内实验中,皮下注射小鼠肝癌细胞H22建立荷瘤小鼠模型,随机分为香菇多糖组(瘤内注射香菇多糖,200 mg/kg,qd×8)与阴性对照组(瘤内注射等体积生理盐水,qd×8),给药结束后,取肿瘤组织做病理切片, H-E染色观察凋亡细胞形态学特征,TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡率;通过免疫荧光法观察香菇多糖对人肝癌细胞HepG2细胞骨架形态学的影响。　　香菇多糖作用于 H22细胞后,在荧光显微镜下可发现凋亡细胞的核染色质浓集,着色较重,并伴有细胞核固缩,核小体碎片增加。在激光共聚焦显微镜下可观察到凋亡细胞通过发芽、起泡等方式形成凋亡小体。在流式细胞仪双变量散点图上可定量分析早期和晚期细胞凋亡率,结果表明两者均具有明显的剂量依赖性,高剂量组(500μg/mL)凋亡率可达15.19％。在流式细胞仪DNA直方图上可发现香菇多糖使细胞阻滞于G2/M期,同时在G1峰前出现了代表细胞凋亡的亚“G1”峰,且该峰随着药物浓度的增加而增大。荧光显微镜的定性观察和流式细胞仪的定量检测结果表明,香菇多糖可剂量依赖性地降低细胞内线粒体膜电位,同时能升高活性氧水平和钙离子浓度。H-E染色结果显示,给予香菇多糖后肿瘤组织中可见散在分布的凋亡细胞,表现为核染色质致密浓缩,核碎裂等。TUNEL染色结果显示,给予香菇多糖后肿瘤组织中出现大量的凋亡细胞,表现为细胞核被染成棕褐色,给药组(200 mg/kg)的凋亡细胞指数为(22.2±4.8)％,与阴性对照组(3.4±2.4)％相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。香菇多糖作用于HepG2细胞12 h和24 h后,均能特异性抑制微管蛋白的聚合。细胞免疫荧光结果显示,大部分细胞内微管解聚,仅在细胞核周围残留少量点状荧光,而对微丝的作用较小,细胞内微丝仍为粗大的较长的束状纤维,应力纤维清晰可见。而作用36 h后,微管不再成束,基本都被解聚,微丝缩短形成较短的束状纤维或颗粒状小体,偶见少数细胞有细小突起,细胞内应力纤维消失,细胞骨架紊乱、瓦解,细胞萎缩、变圆。　　香菇多糖通过抑制微管蛋白的聚合,使姐妹染色单体不能一分为二,将细胞阻滞于G2/M期,肿瘤细胞分裂受阻,进而启动细胞内凋亡程序,出现一系列凋亡细胞特有的形态学特征和生化特征,从而发挥抗肿瘤作用。　　第二部分不同分子量香菇多糖体内抗氧化活性的比较研究　　KM小鼠随机分为正常对照组,衰老模型组,维生素E组,香菇多糖LT1、LT2、LT3均分别设低、中、高剂量组,每组10只。除正常对照组外,其余11组每天皮下注射D-半乳糖100 mg/kg造模,造模的同时灌胃给药干预。给药剂量分别为维生素 E组200 mg/kg,三种香菇多糖低、中、高剂量组均分别为50 mg/kg,100 mg/kg,200 mg/kg。正常对照组和衰老模型组给予等体积的生理盐水。每天给药1次,连续给药60 d,每5天称体重1次以调整给药剂量。末次给药后,所有动物均禁食不禁水24 h,然后眼眶取血于抗凝管中测定红细胞膜流动性(MFU)。取心、肝、脑,用预冷的生理盐水制成10％匀浆,4℃下3000 r/min离心10 min,取上清测定超氧化物岐化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量。　　三种香菇多糖LT1(Mw=25.5 KDa),LT2(Mw=306.2 KDa)和LT3(Mw=605.4 KDa)均有不同程度的抗氧化作用,其中LT2能显著提高衰老小鼠红细胞膜流动性(2.458±0.023 vs.对照组2.167±0.024, p<0.05)和肝脏中SOD(147.19±4.90 vs.对照组82.26±5.55 units/mg protein, p<0.05), GSH-Px(310.91±6.24 vs.对照组243.64±6.77 units/mg protein, p<0.05)的活力,同时显著降低MDA的含量(15.91±0.31 vs.对照组23.79±1.18 nmol/mg protein, p<0.05),其抗氧化作用明显优于LT1和LT3(p<0.05)。　　不同分子量的香菇多糖在体内具有不同程度的抗氧化作用,其抗氧化活性与分子量大小有一定的关系,其中LT2(Mw=306.2 KDa)的体内抗氧化活性最强。