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目的:心房颤动是临床上最常见的心律失常之一,其发病机制复杂,具有高患病率和复发率,严重威胁人类健康。近年来,随着生物测序技术及生物信息学的发展,非编码RNA在心血管疾病中的作用逐渐被发现。本实验中,我们通过分析房颤模型中差异表达的lnc RNAs、circ RNAs和micro RNAs,研究非编码RNA在房颤病理生理过程中的作用机制。方法:(1)将12只健康成年杂种犬随机分为对照组(C,n=6)及快速起搏组(P,n=6),通过对犬右心房以500次/分快速起搏14天建立房颤模型,HE和Masson染色检测心房组织的形态学变化,电生理检测心房有效不应期及房颤诱发率。(2)采用高通量测序以及生物信息学技术分析在起搏组和对照组犬心房组织中差异表达的lnc RNAs、circ RNAs和micro RNAs,构建差异表达谱并通过“火山图、散点图、热图”将这些差异表达的非编码RNA进行可视化,通过GO和KEGG富集分析阐述这些差异表达非编码RNA在房颤中的作用和功能。构建lnc RNA/circ RNA-miRNA-m RNA共表达网络以探索lnc RNAs/circ RNAs和micro RNAs之间的关系。(3)根据生物信息学预测结果,选择cfa＿circ RNA＿009305作为研究对象,血管紧张素II刺激犬心房成纤维细胞建立体外纤维化模型,RT-PCR检测cfa＿circ RNA＿009305在体内和体外纤维化模型中的表达。分别转染si RNA和质粒以沉默和过表达cfa＿circ RNA＿009305,通过免疫荧光、CCK8、细胞划痕实验研究差异表达cfa＿circ RNA＿009305后成纤维细胞的分化、增殖和迁移情况,蛋白印迹法检测纤维化相关蛋白(Collagen I、Collagen III、MMP2、MMP9、α-SMA)的表达变化。通过生物信息学对cfa＿circ RNA＿009305和miR-433之间的关系进行预测,运用RT-PCR和western blot检测miR-433在纤维化模型中的表达及其对纤维化相关蛋白表达的影响。采用Spearman分析对cfa＿circ RNA＿009305和miR-433的相关性进行分析,并通过双荧光素酶报告基因实验检测是二者否具有直接靶向关系。结果:(1)对犬心房快速右心房起搏14天后,组织形态学实验发现,对照组心房肌细胞排列整齐,未见明显形态改变;与对照组相比,起搏组心房肌细胞排列紊乱,形态异常,胶原纤维沉积,发生明显纤维化改变。电生理结果显示,心房有效不应期缩短,不应期离散度增加,房颤诱发率和持续时间明显增高,出现电重构表现。(2)利用高通量测序,共筛选出10310个lnc RNAs,其中差异表达的lnc RNAs共33个,包括19个表达上调,14个表达下调;检测到15990个circ RNAs,差异表达的circ RNAs有146个,其中106个上调,40个表达下调;共发现351个micro RNAs,差异表达的有101个,表达上调的有65个,表达下调的36个;检测到19856个m RNAs,差异表达的有1154个,334个表达上调,820个表达下调。对这些差异表达的非编码RNA和m RNAs进行了GO和KEGG富集分析,发现它们可能通过参与细胞分裂、细胞外基质、活性氧的反应、磷脂酰肌醇代谢、ATP结合、钙离子结合、钾通道调控活性、钠离子的重吸收、MAPK磷酸化活性、TNF信号、Smad信号、Wnt信号通路、c GMP-PKG信号通路、AGE-RAGE信号通路等多个生物过程影响房颤发生。(3)(1)通过血管紧张素II(Ang II)刺激犬心房成纤维细胞成功建立体外纤维化模型,RT-PCR验证发现在cfa＿circ RNA＿009305在体内和体外纤维化模型中均表达下调。(2)CCK8、细胞划痕和免疫荧光实验证实,下调cfa＿circ RNA＿009305促进了成纤维细胞的增殖、迁移及向肌成纤维细胞的分化,同时western blot显示下调cfa＿circ RNA＿009305促进了纤维化相关指标(Col I、Coll III、MMP2、MMP9、α-SMA)蛋白表达增加,而上调cfa＿circ RNA＿009305可逆转这些指标的变化。(3)生物信息学分析发现cfa＿circ RNA＿009305和miR-433之间有碱基配对结合位点。RT-PCR检测发现miR-433在体内和体外纤维化模型中均表达增加,与cfa＿circ RNA＿009305的表达趋势相反,且western blot显示,上调miR-433促进了上述纤维化相关蛋白表达的增加,表明miR-433具有促纤维化作用。Spearman相关性分析显示,cfa＿circ RNA＿009305和miR-433在体外纤维化模型中的表达呈负相关。双荧光素酶报告基因结果提示二者存在靶向关系。细胞实验证实cfa＿circ RNA＿009305可抑制miR-433的表达。因此,推测cfa＿circ RNA＿009305可作为miR-433的ce RNA参与调控miR-433在房颤中的表达。结论:(1)通过对犬快速右心房起搏14天成功建立房颤模型,利用高通量测序和生物信息学分析发现非编码RNA参与调控与房颤发生相关的多种生物过程;(2)cfa＿circ RNA＿009305在体内和体外纤维化模型中均表达下调,且可作为ce RNA海绵吸附miR-433,参与房颤纤维化的进展。