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动脉粥样硬化是一种涉及多种生理、生化和病理变化的慢性复杂疾病。血管内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖和迁移在动脉粥样硬化发生发展过程中发挥着核心作用。最近研究显示,某些circulating miRNA可以稳定存在于外周循环系统中,并且具有心血管疾病标志物的特征。但是,针对动脉粥样硬化发生发展过程中,血清miRNA的变化情况及其参与血管内皮细胞和平滑肌细胞功能异常的分子机制研究目前知之甚少。本课题首先比较了13位冠状动脉粥样硬化患者和5位健康对照样本的血清miRNA表达谱,发现36种miRNA存在显著性差异。随后从中选取了13个miRNA进行qRT-PCR验证实验,并针对差异显著的miR-135b-5p和miR-499a-3p在较大样本中进一步分析。在确认miR-135b-5p和miR-499a-3p在冠状动脉粥样硬化患者血清中异常增高后,本课题针对这两种miRNA可能的分子功能机制开展了初步研究。相关实验结果显示,miR-135b-5p和miR-499a-3p抑制下游靶基因MEF2C(肌细胞增强因子2C)表达,促进血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和迁移。本课题研究结果为揭示miRNA在动脉粥样硬化发生发展过程中的功能及分子机制提供了一定的科学线索和理论依据。研究目的本课题主要研究动脉粥样硬化患者血清中miR-135b-5p和miR-499a-3p的表达,并探索两种miRNA对下游靶基因MEF2C的调控作用。同时探讨miR-135b-5p和miR-499a-3p通过MEF2C对内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖和迁移等细胞行为的作用。研究方法1、血清中miRNA的获取：收集5m1动脉粥样硬化患者外周血,加入促凝剂,分离血清。利用Trizol分离方法,获取血清中miRNA.2、测定动脉粥样硬化患者血清中miRNA的水平：利用引物设计软件设计miR-135b-5p和miR-499a-3p的特异性引物,通过Real-Time PCR检测两种miRNA的表达。3、荧光素酶报告载体的构建：利用PCR技术扩增包含结合位点的MEF2C3’UTR区域,并将该区域连入荧光素酶报告载体,利用双荧光素酶报告试剂盒检测荧光强度的变化。4、Western blot:在HEK293和HUVEC细胞中分别转染miR-135b-5p和miR-499a-3p的mimics或inhibitors。利用蛋白裂解液裂解细胞收集蛋白后,通过ECL试剂盒检测蛋白表达。5、增殖实验：利用EDU试剂盒检测miR-135b-5p和miR-499a-3p对HUVEC和VSMC细胞增殖的影响。6、迁移实验：利用Transwell实验和划痕实验检测miR-135b-5p和miR-499a-3p对HUVEC和VSMC迁移的影响。7、免疫组化实验：利用DAB试剂盒检测动脉粥样硬化斑块处和周围血管壁处MEF2C的表达。实验结果1、动脉粥样硬化患者血清中miRNA表达谱：与健康对照相比,动脉粥样硬化患者血清中异常表达的miRNA有35种,其中25种miRNA高表达,10种miRNA低表达。2、miRNA芯片结果的验证：与健康对照相比,动脉粥样硬化患者血清中miR-135b-5p和miR-499a-3p的表达水平分别提高了8.77倍和1.78倍。3、miR-135b-5p和miR-499a-3p抑制共同下游靶基因MEF2C的表达：与对照组相比,升高miR-135b-5p和miR-499a-3p水平后,MEF2C的蛋白水平分别下降了33.41%和20.48%,Luciferase实验荧光强度分别下降了45.67%和26.39%,而不影响MEF2C的mRNA水平。4. miR-135b-5p和miR-499a-3p促进HUVEC和VSMC的增殖和迁移：与对照相比,升高miR-135b-5p和miR-499a-3p水平后,HUVEC和VSMC的增殖速率和迁移速率明显增加。5、动脉粥样硬化斑块处低表达MEF2C:与周围血管壁相比,MEF2C在动脉粥样硬化斑块处低表达。结论本课题揭示了动脉粥样硬化患者血清中miRNA的表达,其中异常高表达的miR-135b-5p和miR-499a-3p共同调控MEF2C的表达,并通过MEF2C促进HUVEC和VSMC的增殖和迁移。