目的:为了证实TWEAK和Fn14在增殖性糖尿病视网膜病变中上调,并有促使ARPE-19细胞增殖和胶原合成的作用。研究背景:糖尿病视网膜病变严重危害了糖尿病患者的视力,是其视力丧失的主要原因,是糖尿病危害性最大的并发症之一。持续的高血糖引起视网膜微血管的慢性病变,促进糖尿病视网膜病变病理过程的进展。临床上根据糖尿病视网膜病变(DR)的分级标准,出现视网膜新生血管或玻璃体出血和(或)视网膜前出血即发展为增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)。PDR引起反复玻璃体出血,视网膜和玻璃体纤维化,视神经萎缩以及视网膜脱离,最终可导致患者视力严重受损。PDR最显著的特征就是视网膜新生血管的形成,各种血管因子、细胞因子和炎症因子均参与这一过程。以往的重点在于各类血管内皮生长因子和其它具有促血管生成作用的因子的研究。近年来,免疫系统的紊乱和功能失衡以及血管增殖的激活也被认为参与了PDR的病理过程。另外有研究表明,在PDR增殖过程中有多种细胞参与,如成纤维细胞、RPE细胞、胶原细胞等,因RPE细胞参与血-视网膜外屏障的构成,所以RPE细胞的变化在PDR进展中尤为重要。最近肿瘤坏死因子超家族中的新成员被发现具有调节炎症和细胞增殖、促新生血管形成的作用。特别是肿瘤坏死因子样的凋亡弱诱导剂(TWEAK)具有活跃的生物学特性,它通过结合纤维母细胞生长因子诱导分子14(Fn14)激活NF-κB信号通路,调节细胞的存活和增殖,诱导释放Cathepsin B引起细胞死亡,提高前炎症分子MMP9、ICAM1和IL6的表达,而这些细胞因子均已被证实参与了PDR的病理过程。有报道称,在PDR病人玻璃体中有TWEAK和Fn14的基因表达。大量证据表明TWEAK有可能通过TWEAK/Fn14信号通路参与调控PDR的发展。本研究通过检测PDR病人玻璃体中TWEAK和Fn14的表达情况,了解TWEAK和Fn14与PDR的相关性。为确认TWEAK表达与PDR临床病理特征之间的关系,我们进一步研究了视网膜细胞过表达TWEAK后,能够提高该细胞增殖和胶原合成的能力。方法:玻璃体样本的采集通过玻璃体手术分别获得16个PDR病人和21个非PDR的2型糖尿病病人的玻璃体样本。ELISA法检测玻璃体液中TWEAK和Fn14含量通过ELISA法检测两组病人玻璃体液中TWEAK和Fn14的含量。Westernblot法分析玻璃体液中TWEAK和Fn14蛋白的表达量两组病人玻璃体液中TWEAK和Fn14蛋白的表达水平通过与GAPDH带的灰度百分比表示。目的基因的获取从293T细胞获取人的总DNA,通过PCR技术获得TWEAK扩展片段。ARPE-19细胞培养和TWEAK过表达将ARPE-19细胞进行贴壁培养。细胞融合大于90%时,以1:3的比例分代。在ARPE-19细胞中过表达TWEAK。将TWEAK编码序列克隆入pc DNA3.1(+)载体。将TWEAK-pc DNA3.1(+)和对照质粒分别转染入ARPE-19细胞。在G418液体中筛选并保存。RNA提取和定量RT-PCRRT-PCR操作按照试剂盒说明书进行,GAPDH作为内对照。TWEAK和GAPDH引物由Sangon公司合成。Westernblot法分析细胞中TWEAK蛋白的表达量检测过表达ARPE-19细胞在传代不同阶段,细胞中TWEAK蛋白的表达量。细胞计数检测,MTT检测和群落形成检测细胞计数检测获得细胞生长曲线,MTT法检测细胞活力,集落形成实验检测细胞增殖能力。Westernblot法分析细胞中α-SMA,collagen I和collagen IV蛋白的表达量检测过表达ARPE-19细胞在传代不同阶段,细胞中α-SMA,collagen I和collagen IV蛋白的表达量。统计和分析用Graph Pad Prism软件进行统计分析。数据结果表示为平均值加减标准差。两组间对比采用t-test,多组均数对比采用单因素方差分析。P小于0.05视为有统计学意义。结果:PDR病人玻璃体液中TWEAK和Fn14水平升高21个非PDR的T2DM病人和16个PDR病人的玻璃体样本被收录本研究中。为确定TWEAK和Fn14与PDR的相关性,通过ELISA法检测了两组病人玻璃体液中TWEAK和Fn14的含量的变化,结果显示,PDR病人玻璃体中TWEAK和Fn14含量显著升高。通过Westernblot法分析了两组病人玻璃体中TWEAK和Fn14的蛋白表达水平。结果显示,TWEAK和Fn14在PDR病人玻璃体中的蛋白表达水平也随之显著升高,因此,我们认为TWEAK/Fn14信号通路在PDR病人的玻璃体液中表达上调。稳定的TWEAK过表达ARPE-19细胞系的建立从293T细胞中获取人总DNA,利用PCR技术得到TWEAK编码序列扩展片段,然后被克隆入pc DNA3.1(+)载体,ARPE-19细胞被克隆的载体转染,可以获得稳定表达TWEAK的ARPE-19细胞系。TWEAK过表达促进了细胞增殖和胶原在ARPE-19中的合成为了研究TWEAK在ARPE-19细胞增殖中的作用,我们将ARPE-19(TWEAK过表达)组和ARPE-19(阴性对照)组的细胞生长曲线进行对比,我们发现,TWEAK过表达组细胞群在培育3天和5天时的生长速度明显加快。在培育24和48小时后,过表达组细胞的活力较对照组更强。无论初始培育的细胞数目是多少,TWEAK过表达组细胞形成的集落数目显著多于对照组。因此我们认为TWEAK过表达可以引起ARPE-19细胞的增殖和活力的增强。我们进一步研究了纤维化相关分子在两组细胞中的表达情况,结果显示,过表达组细胞中α-SMA,collagen I和collagen IV的蛋白表达水平显著高于对照组,并在细胞传代过程中表达稳定,提示TWEAK能提高纤维化相关分子在视网膜细胞中的表达。结论:在增殖性糖尿病视网膜病变病人的玻璃体中,TWEAK/Fn14通路表达上调。TWEAK/Fn14通过其相关机制推动PDR的病理发展过程。TWEAK/Fn14通路在视网膜ARPE-19细胞增殖和胶原合成中的发挥调节作用。