第一部分：AF1Q基因对乳腺癌细胞侵袭转移潜能的影响及其作用机制 与其它实体肿瘤相似，远处靶器官转移是乳腺癌致死的主要原因。迄今为止，其分子机制尚不清楚。我们实验室前期的工作，通过体内连续筛选方法建立了乳腺癌肺转移裸鼠移植瘤模型，以及高肺转移潜能的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435HM，并运用高通量的cDNA微阵列技术比较分析MDA-MB-435HM及其亲代MDA-MB-435细胞系的基因表达谱差异，发现60个基因显著差异表达。其中，癌基因AF1Q在高转移潜能乳腺癌MDA-MB-435HM细胞中上调表达约4倍。据Tse等报道，AF1Q基因上调表达与白血病及甲状腺癌发生有关。但迄今为止，尚不清楚AF1Q基因是否参与了乳腺癌转移过程，以及在乳腺癌转移过程的作用机制。 本实验探讨AF1Q基因在体内、外对人乳腺癌细胞株侵袭转移潜能的影响及其可能的作用机制。以RT-PCR方法验证AF1Q基因在MDA-MB-435HM及其亲代MDA-MB-435细胞中的差异表达(cDNA微阵列分析结果)；通过RT-PCR介导的限制性核酸内切酶位点添加法构建AF1Q真核表达质粒pcDNA3.1/AF1Q；通过脂质体介导的基因稳定转染技术，将pcDNA3.1/AF1Q质粒导入人乳腺癌MDA-MB-435细胞株，应用抗生素G418筛选及RT-PCR鉴定，构建AF1Q稳定表达的MDA-MB-435细胞株；以稳定表达AF1Q基因的人乳腺癌细胞MDA-MB-435/AF1Q为研究对象，运用Transwell方法观察转染前后各组细胞在体外侵袭能力的变化，并采用RT-PCR、Westernblotting、明胶酶谱技术及ELISA方法检测相关基因(MMP-1，MMP-2，MMP-7，MMP-9Ets-1，TIMP-1，TIMP-2，uPA，uPAR，cathepsinD，maspin，cystatinC，VEGF，bFGF及RhoC)表达的变化；采用RNA干扰(RNAi)实验，探讨AF1Q下调表达对MDA-MB-435细胞体外侵袭潜能的影响，并以Westernblotting方法观察相关基因表达的变化；建立相应的人癌裸鼠原位移植瘤模型以验证体外实验的观察结果；应用RT-PCR方法分析AF1Q基因在临床乳腺癌组织中的表达及其与淋巴结转移的关系。结果显示，AF1Q基因在MDA-MB-435HM细胞中显著高表达，与cDNA微阵列结果相似。通过分子克隆方法成功构建真核表达质粒pcDNA3.1/AF1Q。外源性AF1Q基因和空载体pcDNA3.1通过脂质体介导成功转染入MDA-MB-435细胞，经G418筛选得到两个阳性克隆MDA-MB-435/AF1Q1及MDA-MB-435/AF1Q2。RT-PCR分析显示，与亲代MDA-MB-435细胞及空载体转染细胞相比，MDA-MB-435/AF1Q1及MDA-MB-435/AF1Q2细胞分别上调表达AF1Q基因为5.1及5.2倍。与对照组比较，AF1Q转染的MDA-MB-435细胞体外侵袭能力提高约2倍，MMP-2，MMP-9，转录因子Ets-1以及RhoCmRNA和蛋白表达均明显上调，而各组细胞中MMP-1，MMP-7，TIMP-1，TIMP-2，uPA，uPAR，cathepsinD，maspin，cystatinC，VEGF及bFGF表达水平均未见明显变化(P＞0.05)。RNAi实验显示，与对照组相比，RNAi组的MDA-MB-435细胞下调AF1Q表达约65％，且抑制MDA-MB-435细胞的体外侵袭能力，下调MMP-2，MMP-9，ets-1及RhoC蛋白的表达。裸鼠移植瘤实验表明，AF1Q能促进原位肿瘤生长、肺转移病灶的形成，以及上调移植瘤组织中MMP-2，MMP-9，ets-1及RhoC蛋白的表达。RT-PCR方法分析50例临床外科切除的乳腺癌组织标本，结果显示AF1Q基因在78％(39/50)的乳腺癌组织中高表达。统计分析显示，AF1Q高表达与淋巴结转移呈正相关(FishersExacttest；P=0.037)。这些结果表明，AF1Q基因能促进乳腺癌细胞生长、侵袭转移潜能，可能与其上调细胞侵袭转移相关基因MMP-2，MMP-9，ets-1及RhoC的表达有关。 第二部分：乳腺癌转移相关候选蛋白质的筛选与鉴定 近年来，蛋白质组学技术在寻找肿瘤早期诊断的生物标志物及新的分子治疗的药靶、评价药物的疗效方面取得了较大进展。但迄今为止，应用蛋白质组学技术探讨乳腺癌转移发生的相关文献较少。本研究以本实验室建立的高、低肺转移潜能人乳腺癌细胞株为实验模型，采用蛋白质组学技术比较其蛋白质表达谱差异，以筛选和鉴定乳腺癌转移相关蛋白质。采用固相pH梯度双向凝胶电泳(2-DE)技术，分离具有相同遗传背景的高、低肺转移潜能人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435HM及MDA-MB-435LM)的总蛋白质，银染显色，获得了重复性和分辨率均较好的双向电泳银染图谱。MDA-MB-43HM及MDA-MB-435LM细胞6次2-DE图谱蛋白质点的匹配率分别为93.7％±3.7％及93.6％±3.9％。PDQuest2-DE软件分析差异表达的蛋白质，发现MDA-MB-435HM与MDA-MB-435LM细胞之间共有102个蛋白质点存在3倍以上丰度变化。采用生物质谱鉴定技术，对部分差异蛋白点用液相色谱-离子阱-质谱(LC-IT-MS)分析其胶内酶解后的肽谱和各肽段的氨基酸序列，用SEQUEST软件查询NCBI蛋白质数据库，成功鉴定了11个乳腺癌转移相关候选蛋白质，包括组织蛋白酶前体(CATD)、peroxiredoxin6(PDX6)、α晶状体球蛋(CRAB)、原肌球蛋白1-4(TPM1-4)、热休克蛋白60(HSP60)及肿瘤蛋白D54(TD54)等，这些候选蛋白质涉及细胞生长代谢、迁移、信号转导和免疫调节等多种生物功能以及许多未知功能。随机选取了4个差异候选蛋白质，包括抗氧化蛋白peroxiredoxin6(PDX6)、α晶状体球蛋白(CRAB)、热休克蛋白60(HSP60)以及原肌球蛋白质4(TPM4)，用RT-PCR及Westernblotting方法在高、低肺转移潜能的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435HM及MDA-MB-435LM中验证，结果与蛋白质组学结论基本一致。这些结果为下一步探讨这些候选蛋白质在乳腺癌转移过程的功能及其作用机制打下了基础。