小麦种子储藏蛋白是人类最主要的植物蛋白来源,与小麦的面粉加工品质密切相关。高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦种子胚乳中最重要的储藏蛋白之一。HMW-GS的结构与等位变异组成是小麦面粉加工品质最主要的决定因素。六倍体普通小麦中HMW-GS的等位变异类型相对有限,而在普通小麦的近缘物种中存在丰富的等位变异类型。因此,从近缘物种中发掘新型高分子量谷蛋白基因成为普通小麦品质改良新基因的重要来源。利用SDS-PAGE方法,从一份新疆稻麦材料稻麦—2中鉴定了一对高分子量谷蛋白亚基组合1Dx2.1+1Dy10.1,这对亚基在SDS-PAGE电泳图谱中具有独特的电泳迁移率,在普通小麦中没有该亚基报道,并利用PCR克隆的方法对这一亚基组合的编码基因进行分离,并进行体外表达。HMW-GS 1Ay基因具有在普通小麦中完全不表达的特性,而不同于其他等位基因。但是关于1Ay基因沉默的机制,还未有准确的结论。本研究从乌拉尔图小麦、野生一粒小麦、栽培二粒小麦(栽培二粒)中不同类型的1Ay亚基基因编码区和启动子调控区序列进行了克隆和比较分析,并对25个小麦族二倍体物种高分子量谷蛋白启动子进行了鉴定,综合这些结果,分析了1Ay基因沉默的机制。此外,对这些二倍体物种的启动子调控元件结构特征进行了分析,并以鉴定的启动子序列进行了二倍体物种的系统进化分析。1BL.1RS易位系因其优良的抗病性和对不良环境适应能力,广泛应用于小麦生产和育种工作中,但1BL/1RS易位系存在面团弹性弱和强度比非易位系显著下降等加工品质较差的缺陷。1RS上携带的ω-secalins编码基因被认为是1BL/1RS易位系小麦品质下降的主要原因。关于ω-secalins的研究的报道仍然很少,本研究对其不同R染色体相关物种的ω-secalins进行了研究。取得的主要研究结果如下:1.通过SDS-PAGE分析,表明新疆稻麦高分子量谷蛋白亚基组成包括4个表达的亚基,具体组成是:null,1Bx7+1By8,1Dx2.1+1Dy10.1。在SDS-PAGE图谱上,亚基1Dx2.1位于亚基1Ax1和亚基1Dx2之间,略比亚基1Ax2~*慢;而亚基1Dy10.1的迁移率低于亚基1Dy10,但比亚基1By9快。利用一对扩增高分子量谷蛋白亚基基因完整编码区的引物,对新疆稻麦材料稻麦-2的总DNA进行扩增,获得大小分别为1.8、1.97、2.2和2.5 kb的4条片段。将4条片断分别克隆、测序和进行序列比较后,确定大小为2.5 kb的片段是高分子量谷蛋白亚基1Dx2.1的基因编码区,命名为1Dx2.1;而1.97 kb片段是的亚基1Dy10.1基因编码区1Dy10.1。1Dx2.1和1Dy10.1推导的氨基酸一级结构都由保守的N-末端、C末端和较长的中部重复区组成。1Dx2.1全长2514bp,编码836个氨基酸;1Dy10.1的完整编码区全长1971bp,编码655个氨基酸残基。两个亚基都含有保守的半胱氨酸残基数目和位置分布,具有高分子量谷蛋白亚基的典型特征。根据推导的N-末端和C末端氨基酸序列进行聚类,结果1Dx2.1和1Dy10.1与普通小麦D基因组编码的x和y型高分子量谷蛋白亚基分别聚为一类。1Dx2.1与来源于二倍体山羊草属物种节节麦(Aegilops tasuchii)的1Dx2.1~t表现出较近的亲缘关系。2.利用SDS-PAGE从普通小麦的近缘物种乌拉尔图小麦、野生一粒小麦和栽培二粒小麦和硬粒小麦等141份材料中鉴定出53份材料具有表达的1Ay亚基,频率为37%。在一份野生一粒小麦材料(PI306526)中,1Ay亚基的亚基迁移率比所有的y型亚基和1Bx7都慢,接近于1Dx2亚基。由此,该亚基具有较大的分子量,具有相似电泳迁移率的y型高分子量谷蛋白亚基还未见报道。根据这些结果,选择了9份材料用做进一步的克隆分析,获得的1Ay基因大小范围为1800-2202bp。来自不同材料的6个表达的1Ay亚基的分子量大小差异较大,但它们都具有典型的高分子量谷蛋白亚基的一级结构。其中,亚基1Ay(Ta-e3)由732个氨基酸组成,比目前其他所有已知的y型亚基的分子量都大。根据氨基酸序列比对的结果表明,1Ay(Ta-e3)与其他亚基分子量差异主要是由于重复区重复单元数目的变化引起的。和其他的1Ay亚基相比,1Ay(Ta-e3)重分区具有额外的13个六肽和5个九肽,导致123个氨基酸的增加。本研究发现,在野生小麦中重复区末端保守的半胱氨酸残基并不总是存在,有时被苯丙氨酸替代。即在亚基1Ay(Tu-e1)、1Ay(Tu-e2)、1Ay(Ta-e2)和1Ay(Td-e)的重复区末端的保守半胱氨酸被苯丙氨酸替代。1Ay(Tu-s)、1Ay(Ta-s)和1Ay(Td-s)的翻译被编码区的终止密码子提前终止。来源于不同物种的沉默的和表达的1Ay亚基启动子进行比对分析表明,所有的1Ay亚基启动子区序列表现出高度的相似性,仅不同于一些个别碱基的替代、插入和缺失(图3.4)。调控元件N motif、E motif、complete enhancer和TATA box具有高度的保守性。将1Ay亚基启动子与1By9和1Dy10相应序列进行比对时,在不同物种的(二倍体,四倍体和六倍体小麦)不同表达类型(沉默的和表达的)的1Ay亚基启动子区序列中都有一个85 bp的片段缺失。在缺失的这一区段中,包括调控元件partial HMWenhancer。本研究将1Ay亚基的启动子序列延伸到-845bp,没有在这些区域发现显著的序列和调控元件变异,全部的1Ay亚基启动子区序列表现出高度的保守性。由此,重复区的变异(提前终止密码子和转座子插入)是不同物种中1Ay基因沉默可能原因之一。在系统进化分析中,所有1Ay基因表现出较近的亲缘关系,尤其是来源于乌拉尔图小麦、栽培二粒小麦和六倍体普通小麦(栽培品种Cheyenne)的1Ay基因形成一个紧密的类群,表现出较近的亲缘关系,而这3个物种都是小麦进化过程中涉及的重要物种。而来源于野生一粒小麦的1Ay基因则和该类群关系稍远,单独形成一个亚类群。这些类群具有较高的自举法检验值支持,表明来源于乌拉尔图小麦、栽培二粒小麦和六倍体普通小麦的1Ay间的亲缘关系具有较高的可信度。3.对25个小麦族二倍体物种的y型高分子量谷蛋白启动子(y-HGP)序列进行了鉴定和分析。在25个物种中,y-HGP长度变化范围是845-915bp。序列多重比对的结果表明,启动子序列总体较为保守,但也存在一定程度的变异,其中各个启动子调控元件表现出较高的保守性。基于y-HGP的25个物种遗传距离变幅为0-22%,包含外类群的变幅为0-36%。在启动子调控元件之间的序列中,同样存在一些插入和缺失。在Triticum、Aegilops和Hordeum 3个属的8个物种中都发现了85bp片段缺失。值得注意的是,在Psathyrostachys、Hordeum和Pseudoroegneria中的一些变异具有物种特异性的特点。系统进化分析(简约法和贝叶斯分析)支持Aegilops/Triticum复合群中物种紧密的亲缘关系。同时,Pseudoroegneria与Australopyrum,Dasypyrum和Agropyron较近的亲缘关系也得到简约法和贝叶斯分析的强烈支持。由于y-HGP序列具有足够的遗传变异并且在二倍体物种是单拷贝,因此在小麦族物种系统进化研究中可作为有效的候选基因。4.对黑麦,六倍体和八倍体小黑麦以及1BL/1RS易位系中的ω-secalins进行了鉴定和分离。蛋白分析表明,ω-secalins在不同物种中的大小都在50KDa左右。对这些来源于这些物种的ω-secalins的编码基因进行克隆,共获得62条完整的基因编码序列,其中19条基因序列能够编码完整的ω-secalins蛋白,43条为不能编码完整的ω-secalins蛋白的假基因。蛋白质序列分析表明,ω-secalins的氨基酸一级结构由信号肽、N-末端区、重复区和C-末端区组成。其中信号肽有19个氨基酸组成,并且高度保守,仅在FJ561479中有1个氨基酸的变化。N-末端区同样较为保守,来自于不同材料的全部ω-secalins都以RQL起始,不同于普通小麦中的ω-gliadin蛋白的四种类型:KEL/ARQ/ARE/SRL。C-末端区则由高度保守的6个氨基酸(PFVVVV)组成。物种之间和物种内的变异都以相同的形式出现,即单个氨基酸的替换和重复单元的缺失或插入,重复单元中部分氨基酸的缺失也有出现。同义突变(Ks)和非同义突变频率(Ka)分析表明,在假基因中非同义突变的比例要高于真基因。