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钙调磷酸酶是目前所知唯一受Ca2+/钙调素调控的Ser/Thr蛋白磷酸酶,由一个催化亚基CNA和一个调节亚基CNB组成的异源二聚体。催化亚基CNA主要参与真菌的孢子形成及菌丝形态,调节细胞内阳离子平衡,细胞壁的合成及病原真菌致病性。课题组前期从昆虫病原真菌球孢白僵菌中克隆了钙调磷酸酶催化亚基Bbcna,发现Bbcna影响菌落形态、分生孢子产生以及影响白僵菌对杀真菌剂咯菌氰的敏感性。破坏Bbcna导致菌株毒力下降,并且与分生孢子疏水性和附着性下降和附着胞形成率下降密切有关(武增强,2010)。另外,研究发现Bbcna突变体容易失活,推测Bbcna可能参与球孢白僵菌环境适应性调节。有关Bbcna调节菌株生长发育、活力及细胞表面特性的生理生化机制,尚待进一步明确。本论文通过重新构建Bbcna破坏突变体,结合回复互补,进一步探究了Bbcna与菌株活力、发育分化及细胞壁结构及表面特性、毒力的关系及可能机制,并通过比较转录组学分析Bbcna与细胞壁结构完整性(CWI)信号途径Bbslt2的关系。主要研究结果如下：1.破坏Bbcna影响菌株生长发育破坏Bbcna基因影响了球孢白僵菌生长发育,导致分生孢子产生显著降低,孢子活力下降。在完全培养基1/4SDAY与PDA和基本培养基CZM平板上,ABbcna的生长速率分别比野生菌株下降了16.23%、44.12%和28.57%。在1/4SDAY、PDA和CZM平板上,ABbcna的产孢量分别比野生菌株下降了43.68%、51.89%和22.23%。分生孢子萌发率检测结果表明,破坏Bbcna延迟了孢子萌发速率,新鲜分生孢子萌发中时比野生菌株延长了2.5h左右。随着贮存时间的延长,△Bbcna (?)舌力下降迅速。在4℃和26℃贮存40d,野生菌株的孢子活力分别为90.35%和92.08%,而△Bbcna的活孢率分别下降至33.32%和55.37%。分生孢子活性氧(ROS)检测结果发现,△Bbcna孢子随贮存时间的延长,胞内ROS相对于野生菌株的水平则呈上升趋势。由此推测,△Bbcna可能参与胞内活性氧的调节,影响菌株活力。2. Bbcna调节细胞壁结构完整性破坏Bbcna引起菌株对细胞壁合成抑制剂刚果红的敏感性增强。刚果红对ABbcna半抑制浓度为2.819mg/mL,显著低于对野生菌株的半抑制浓度(4.642mg/mL)。透射电镜观察发现,破坏Bbcna影响了细胞壁结构,细胞壁明显变薄。细胞壁成分测定结果表明,破坏Bbcna导致细胞壁总糖含量和p-1.3以及p-1,6葡聚糖含量上升,而几丁质含量却显著下降。由此推测,Bbcna可能通过调节细胞壁组成,影响细胞壁结构和完整性。3. Bbcna影响球孢白僵菌细胞表面特性疏水性测定结果表明,破坏Bbcna降低了分生孢子疏水性,突变体疏水性比野生菌株下降了41.54%。固体表面附着性测定结果发现,ABbcna在疏水表面的附着性显著低于野生菌株,而在亲水表面的附着性却显著高于野生菌株。植物凝集素结合试验发现,ABbcna对ConA(检测葡聚糖)和WGA(检测G1cNAc)结合明显低于野生菌株,而对GNL(检测α-甘露糖)的结合却强于野生菌株。由此表明,破坏Bbcna影响了细胞表面疏水性、附着性和碳源表位。4.破坏Bbcna导致菌株毒力下降通过“经典”的体壁接种和微量注射孢子至虫体内进行生物测定,发现破坏Bbcna菌株毒力显著降低。在相同接种剂量下(孢子浓度),体壁接种和注射接种的突变体对大蜡螟的LTso分别比野生型延长了19.87%和21.3%。由此表明,ABbcna是菌株毒力的一个重要影响因子。5. Bbcna和Bbslt2调控的差异表达基因分析在刚果红胁迫条件下,与野生菌株相比,△Bbcna共有603个基因的转录水平发生显著变化,包括350个上调基因和253个下调基因；而细胞壁完整性信号传导途径相关的调控因子△Bbslt2中共有102个基因转录水平发生显著变化,包括31个上调基因和71个下调基因。与野生菌株相比,在△Bbslt2和△Bbcna中有8个基因共同上调,32个基因共同下调,分别占△Bbslt2中上调和下调基因的25.81%和45.07%。这些共同上调和下调的40个差异基因,涉及细胞壁合成、细胞膜代谢、氧化胁迫相关等生物学过程。由此表明,钙调磷酸酶信号途径(Bbcna)和Bbslt2途径在调控球孢白僵菌细胞壁结构完整性过程中存在明显的交互作用(crosstalking)。