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狂犬病是重要的人兽共患传染病，引起中枢神经系统的感染，病死率几乎100％。我国是狂犬病的多发区，近年来，我国人狂犬病病例攀居世界第二.家养犬是我国狂犬病的重要传播宿主，85％～95％的人狂犬病病例是由犬咬伤所导致，50％～70％的狂犬病病例发生在农村.由于缺少安全有效、价格低廉、使用方便的动物狂犬病疫苗，加之群众意识淡薄，导致我国家犬的免疫覆盖率极低，野生动物更无狂犬病的计划免疫.
犬及犬鼬科野生动物是狂犬病病毒侵入人群的主要传播媒介.因此研制安全有效的动物用狂犬病疫苗，是预防人狂犬病的关键.本实验室在前期的工作中，建立了以犬2型腺病毒（CAV-2）弱毒株为载体表达狂犬病病毒弱毒株SRV,糖蛋白的重组CAV-2疫苗(CAV-2-CGS)，免疫试验结果表明，该重组疫苗可诱发机体产生较高水平的针对狂犬病病毒的免疫力.但是与完整狂犬病病毒免疫相比，仍然有较大的提高空间.重组疫苗免疫中和抗体产生水平不高，影响因素可能有保护性抗原基因的选择、外源基因的表达水平、体内初始腺病毒抗体的干扰等。因此为了进一步提高该重组病毒的免疫效价，本研究作为整个课题的一部分，选择狂犬病强毒8202株的糖蛋白膜外区作为保护性抗原，以犬2型腺病毒pⅨ为展示表达载体，构建重组犬2型腺病毒.同时对8202株糖蛋白膜外区重组病毒进行犬免疫试验，检测重组病毒免疫原性，制备狂犬病重组活载体疫苗候选株，为狂犬病重组活载体疫苗研究奠定基础.同时探讨CAV-2pⅨ表达外源基因的调控，为完善该病毒载体，提供理论依据.
研究首先在前期获得的CAV-2感染性全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2的基础上，对其pⅨ进行改造，构建了改进的CAV-2载体pPolyⅡ-CAV-2-pⅨ-RVG;扩大了该载体插入外源基因的容量，完善了CAV-2载体展示研究.然后对CAV-2pⅨ的羧基末端插入带有pEGFP-C1polyA的狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区基因，转染犬肾细胞系（MDCK），成功获得了重组病毒CAV-2-pⅨ-RVG。
对重组病毒CAV-2-pⅨ-RVG进行了生物学特性及pⅨ表达调控研究。通过电镜观察、细胞半数感染量(TCID50)测定、血凝和血凝抑制试验，检测病毒的形态、反应原性、生长特性。通过PCR、RT-PCR、Westernblot方法对重组病毒的遗传稳定性和糖蛋白膜外区基因的转录和表达量进行了检测，探讨CAV-2pⅨ的外源基因的插其pⅨ表达调控的影响.同时为比较两株重组病毒的免疫原性之间的差别，对该重组病毒与前期实验室构建的CAV-2-CGS，进行免疫实验研究.结果显示，该株重组病毒具有典型的腺病毒形态结构;相同TCID50的重组病毒和疫苗株病毒都能凝集人的红细胞，血凝效价没有差别;相同TCID50重组病毒和疫苗株病毒接种MDCK细胞，病毒增殖特性与疫苗株病毒没有差异;重组病毒在体外连续传代，性质稳定，没有出现外源基因的缺失和重排;重组病毒感染细胞后能够稳定转录和表达狂犬病病毒糖蛋白，具有良好的反应原性;pⅨ对外源基因的表达量无影响.
对表达狂犬病强毒株8202株糖蛋白膜外区的重组病毒CAV-2-pⅨ-RVG，通过口服和肌肉注射两种免疫途径对犬进行免疫试验。免疫时每条犬口服2mL(108TCID50/0.1mL)病毒，免疫前及免疫后每周采血.经Western-blot分析抗体组成;HI检测腺病毒抗体血凝抑制效价;荧光抗体病毒中和试验(FAVN)测定抗体中和效价。结果显示，重组病毒在犬体内同时诱导产生了针对狂犬病病毒和腺病毒的两种特异性抗体.HI试验表明，该株重组毒与疫苗株病毒血凝效价消长规律基本一致.犬首次免疫后产生的抗狂犬病病毒中和抗体效价为2.47IU±0.35IU，抗体的消长规律相同。重组病毒CAV-2-pⅨ-RVG可以在犬体内产生具有保护水平的中和抗体（0.5个国际单位以上）。
综上所述，本研究成功构建了可以表达8202株糖蛋白膜外区的CAV-2pⅨ展示载体pPolyⅡ-CAV-2-pⅨ-RVG;构建了表达狂犬病病毒强毒株8202株糖蛋白膜外区的重组犬2型腺病毒CAV-2-pⅨ-RVG.证明CAV-2pⅨ对病毒的生物学特性无影响，对外源基因表达量无影响;表达狂犬病病毒强毒株8202株糖蛋白膜外区的重组病毒疫苗CAV-2-pⅨ-RVG，可以刺激机体产生具有保护水平的中和抗体，免疫效果与前期CAV-2-CGS重组毒差异不显著，可以作为狂犬病重组疫苗候选株。