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生物柴油的大规模生产,导致了其副产物——甘油大量累积,促使大批的科学工作者致力于甘油利用途径的研究。由于3-羟基丙酸自身优良的物化性质和广泛的应用前景,以甘油为底物,构建基因工程菌生产3-羟基丙酸成为近年来研究的热门课题。科研人员从醛脱氢酶的挖掘、共表达载体的筛选、宿主的选择和发酵条件等方面来改善和解决该路径中存在的相关问题,达到提高3-羟基丙酸产量的目的。本课题以提高3-羟基丙酸产量为目标,以实验室构建保藏的菌株E.coli DH5α(pET-28b-kgsadh,pCDFDuet-DhaB)为研究对象,采用 EP-PCR方法对醛脱氢酶进行分子改造,考察和确定了静息细胞生物转化生产3-羟基丙酸的反应体系,完善3-羟基丙酸发酵补料工艺。主要研究结果如下:(1)醛脱氢酶的分子改造:设计EP-PCR突变引物,确定了引物退火温度;通过改变EP-PCR体系中Mn2+浓度,对KGSADH醛脱氢酶基因进行克隆和随机突变,构建了突变文库。(2)通过单因素实验优化了静息细胞生物转化生产3-羟基丙酸的反应体系:通过反应进程曲线,确定了最佳的取样时间为6～7 h;优化了细胞终浓度为20 g/L;甘油最适浓度为20 g/L;辅酶VB12选择终浓度为10 mg/L;NAD+终浓度为0.15 mM;转化温度为35℃和0.05mol/L pH=7.0的Tris-HC1缓冲液。在最佳条件下醛脱氢酶活力达到最大值为16.77U/gDCW,甘油脱酶活力为57.91 U/gDCW,3-羟基丙酸产量为3.17 g/L,产量比优化前提高了 33%。(3)基于分批发酵参数的基础,对VB12和补料培养基添加方式进行了优化,确定了补料工艺。在分批发酵时,分两次等量添加VB12,发酵36 h,3-羟基丙酸产量为6.81 g/L,菌体干重为3.98 g/L,比一次性添加VB12分别增加了 12%和17%;在分批补料时,当葡萄糖浓度下降至3 g/L开始添加葡萄糖,此时菌体干重3.97 g/L,产物3-羟基丙酸产量为6.34 g/L。当甘油和葡萄糖混合培养基流加补料时,确定工艺为:在10 h开始恒速流加,发酵34 h后3-羟基丙酸产量达到最大值7.17 g/L,菌体干重达4.62 g/L,比单独补加葡萄糖分别增加了12%和 13%。本课题为进一步改善和解决3-羟基丙酸合成途径中的相关问题奠定了一定的理论基础。