二穗短柄草CBF2基因载体构建及转基因拟南芥的抗性分析

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:JK0803_lijixiang
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本文以二穗短柄草CBF2基因和拟南芥为研究对象,采用gateway技术构建了CBF2基因的植物表达载体pK24-35S-CBF2,通过农杆菌介导法,将其转入拟南芥。在组培条件下,将转化植株的种子进行三代筛选,得到纯合的阳性植株。利用其研究转基因拟南芥种子、幼苗及成苗在干旱、盐碱胁迫下的生理生化反应,探讨拟南芥在干旱、盐碱胁迫下的生理反应特性及CBF2基因的功能。实验主要结果如下:  1、使用gateway技术构建CBF2基因的植物表达载体pK24-35S-CBF2,并通过农杆菌EHA105介导的方法,将二穗短柄草CBF2基因转入拟南芥中。将转基因拟南芥进行卡那霉素筛选,一代得到13株阳性植株,二代和三代筛选后,得到7个转基因拟南芥株系,萌发率与转化率皆在80%以上。将7个株系进行PCR鉴定,皆得到目的条带,即成功获得7个转二穗短柄草CBF2基因拟南芥株系。  2、取萌发率和转化率皆在90%以上的3个T3代转基因拟南芥株系的种子及植株进行抗旱性实验。结果表明在种子阶段转基因与野生型拟南芥的抗旱性无明显差异。幼苗时期,甘露醇浓度为100、150、200、250、300mmol/L时,转基因幼苗根长增长量显著高于野生型幼苗,说明转基因幼苗时期抗旱性增强。而在苗期的干旱处理中,转基因拟南芥在表型上与野生型有一定差异,表现出了更强的生命力,转基因植株遭遇干旱胁迫后,MDA与外渗电导率值皆显著低于野生型植株,细胞膜损伤比野生型拟南芥更小,且植物体内的POD酶活性在处理8-20d内始终高于野生型拟南芥。说明CBF2基因在一定程度上增强了转基因拟南芥在幼苗和成苗阶段的抗旱能力。  3、将T3代转基因拟南芥种子及植株进行耐盐性的研究。结果表明:NaCl浓度为100、150、200mmol/L时,转基因各株系的种子萌发率显著高于野生型拟南芥。幼苗时期,随着NaCl浓度的增加和胁迫时间的延长,转基因各株系的根长增长量显著高于野生型。转基因拟南芥苗期用150和250mmol/L NaCl处理,随胁迫天数增加,转基因植株在表型上表现出了更强的耐盐能力。而150mmol/L和250mmol/L NaCl处理下,转基因拟南芥各株系植株的SOD、POD酶活性在处理的中后期显著高于野生型植株,且变化趋势更平缓。MDA含量与外渗电导率值显著低于野生型植株,说明CBF2转录因子的调控,增强了转基因植物清除活性氧自由基的能力,减轻了转基因拟南芥在盐胁迫下的膜脂过氧化作用。最终发现:在抵御NaCl胁迫的过程中,CBF2基因的表达在转基因拟南芥的各个生长阶段均有效增强了其耐盐能力。  4、将T3代转基因拟南芥种子及植株进行NaHCO3协迫试验。结果发现:NaHCO3浓度为7.5和10mmol/L时,转基因拟南芥各株系种子萌发率明显高于野生型,幼苗时期NaHCO3浓度为2、5、7.5、10mmol/L时,转基因各株系幼苗根长增长量显著高于野生型幼苗。随着NaHCO3浓度的增加,转基因植株与野生型植株表型差异明显,且最终成活率明显高于野生型拟南芥。采用不同浓度NaHCO3处理转基因拟南芥成苗,测得转基因植株SOD、POD酶活性在处理中后期显著高于野生型拟南芥,MDA含量与外渗电导率值显著低于野生型拟南芥。说明CBF2基因的表达引起了抗氧化酶类的响应,维持了植物细胞膜的稳定性。最终发现:转基因拟南芥在各个时期与野生型拟南芥相比均对NaHCO3具有更强的抗性。
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