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自然界中,生物膜形成对细菌的环境适应至关重要,但其调控网络非常复杂,通常分为转录调控和转录后调控两种方式。大量研究发现,胞外多糖是影响生物膜形成的最重要的组分,环二鸟苷酸（c-di-GMP）则是调控胞外多糖重要的第二信号分子。在假单胞菌中,RNA结合蛋白RsmA结合到胞外多糖及c-di-GMP合成相关基因的mRNA上抑制其表达,非编码RNA RsmX、RsmY和RsmZ则通过与RsmA结合解除其抑制作用。此外,sigma因子RpoN和RpoS也被证明参与调控生物膜形成,但其调控方式缺乏深入研究。本论文以水稻根际联合固氮施氏假单胞菌A1501为研究对象,系统开展固氮生物膜形成的网络调控机制研究,取得如下研究结果:1.研究了碳源和氮源对固氮生物膜形成的影响。在碳源丰富而无氮源条件下,A1501生物膜形成和固氮能力最强。当NH4+浓度提高到0.5 mM时,非生物膜细胞固氮酶活性被完全抑制,但生物膜的固氮酶活性还保留69%,同时生物膜条件下固氮基因高表达,表明生物膜形成能增强固氮酶表达对NH4+的耐受性。2.RsmA在转录后水平上抑制胞外多糖合成调控因子algU和c-di-GMP合成酶基因sadC的表达,负调控生物膜的形成。rsmA基因的突变提高了algU和sadC基因表达的蛋白水平,导致胞内c-di-GMP的水平以及胞外多糖的含量显著增加,进而增强生物膜形成能力。凝胶阻滞实验进一步表明,RsmA蛋白与algU和sadC的mRNA的特异性结合,这种结合在转录后水平上抑制了基因表达。3.凝胶阻滞实验证明非编码RNA RsmX、RsmY和RsmZ特异性结合RsmA蛋白,表明这些非编码RNA通过特异性结合RsmA蛋白,解除其对生物膜形成的抑制作用。RsmY和RsmZ的缺失突变导致生物膜形成能力下降,而RsmY和RsmZ的过量表达则增强生物膜的形成。转录调控因子GacA突变株中RsmX、RsmY和RsmZ的表达下降10倍以上,表明其表达为GacA依赖型。RpoS的突变导致生物膜形成能力显著的增强。RsmZ的表达在RpoS突变株中表达量增加,表明RpoS可能通过未知方式负调控生物膜形成。4.RpoN突变导致固氮能力和生物膜形成能力完全丧失,表明其在生物膜形成过程中起至关重要的调节作用。糖基转移酶PslA突变株的胞外多糖含量为野生型的34%,生物膜形成能力完全丧失,表明胞外多糖是生物膜形成的关键因子。RpoN突变株中固氮调节基因nifA表达下调50多倍,胞外多糖合成基因pslA表达下调10多倍。nifA和pslA启动子区包含RpoN保守识别位点(GGN10GC),凝胶阻滞实验证实RpoN蛋白与nifA和pslA启动区DNA直接结合,表明RpoN主要通过直接激活pslA和nifA的表达,在转录水平上正调控固氮生物膜形成。5.提出了固氮生物膜形成的网络调控模型。在转录水平上,RpoN感应无氮信号,通过调控pslA等基因的表达,增加胞外多糖合成,同时调控nifA的表达激活固氮作用,进而正调控固氮生物膜的形成。在转录后水平上,GacA激活非编码RNA RsmX、RsmY和RsmZ的转录表达,后者通过与RsmA结合,解除其对AlgU和SadC的表达的转录后抑制作用,正调控固氮生物膜形成。