目的：以人表皮生长因子受体(EGFR)作为分子靶标,构筑可特异性筛选酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的毛细管电泳酶微识别反应器。结合毛细管电泳(CE)高效微分离技术,发展一种可用于我国民族特色抗肿瘤药材活性成分的快速筛选方法,并实际应用于新疆紫草萘醌类提取物中TKI的筛选。在单一酶微识别反应器的基础上进一步构建可寻址的分段多酶微识别反应器,用于混合物中不同组分与相应蛋白酶特异性相互作用的研究。方法：1.基于不同原理的酶固载化技术,包括离子键合法、离子键合结合交联剂法以及共价键结合法制备毛细管电泳酶微识别反应器。比较不同方法制备的反应器性能,选择最优的固定方法。以激活的EGFR为靶标分子,构筑EGFR酶微识别反应器。2.以EGFR磷酸化底物ATP,已知酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和阴性对照苯丙氨酸作为分析物验证EGFR酶微识别反应器可特异性识别筛选TKI。3.采用冷浸法,提取新疆紫草中的萘醌类组分。进一步建立萘醌类组分的毛细管电泳高效分离模式。4.利用毛细管电泳EGFR酶微识别反应器对新疆紫草中的萘醌类组分进行识别筛选。比较分析物通入裸管和酶微识别反应器的电泳谱图,通过对应组分峰的顺序和面积变化判断具有EGFR酪氨酸激酶活性抑制作用的有效成分。5.以胰蛋白酶、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和EGFR为模型酶,通过控制反应条件制备可寻址的分段多酶微识别反应器,结合毛细管电泳分离技术,对混合分析物进行在线分离测定,用于混合物中各组分与不同蛋白酶间特异性相互作用的分析。结果：1.分别使用磷酸盐及硼酸盐两种缓冲体系作为制备EGFR酶微识别反应器的背景溶液。发现在浓度为0.1mol/L,pH8.0的条件下,磷酸盐缓冲体系形成电流约为硼酸盐缓冲体系的6倍,考虑焦耳热效应带来的影响,最终选择硼酸盐缓冲液作为实验的缓冲体系。2.比较四种EGFR酶微识别反应器的制备方法,发现共价键结合法制备得到的反应器可连续使用50次以上,并且吉非替尼与EGFR结合量的变化值以峰面积计算小于1500。其它三种方法制备得到的反应器使用次数少于20次,且吉非替尼与EGFR的结合量随测定次数增加而递减,减少值大于12000。3.以激活的EGFR为靶标,采用共价键结合法制备EGFR酶微识别反应器。将浓度为0.5mmol/L的ATP底物溶液通入反应器,经过孵化和分离,发现约31%的ATP与EGFR发生结合。相同浓度下,吉非替尼与EGFR的结合量约为37%。向底物溶液中加入不同浓度的吉非替尼,ATP与EGFR结合量减少,产物峰面积减小。根据不同浓度吉非替尼的抑制率绘制IC50曲线,计算得到IC50=32.44±0.82μmol/L。4.利用毛细管电泳法对新疆紫草中萘醌类提取物进行高效分离,以含20%无水乙醇的硼酸盐缓冲液(pH8.0)作为运行缓冲液,共检测到5种组分。5.基于特异性识别作用,利用毛细管电泳EGFR酶微识别反应器筛选萘醌类提取物中潜在的TKI。发现β-羟基异戊酰基紫草素(β-HIVS)在作用前后发生显著变化,峰面积减少52%以上。提示其与EGFR发生了特异性结合。进一步研究发现β-HIVS可明显抑制EGFR酪氨酸激酶活性。6.制备分段多酶微识别反应器。与固定混合酶相比较,分段固定的酶催化作用更显著。随着反应器长度的增加,底物的转化率增加,当各段反应器长度为9.64mm时,转化率达到最大值。超过此长度,分离效果不佳。并且随着运行缓冲液pH值增大,分离效果逐渐改善,但pH过高可能影响酶活性,本实验最终选择pH值为9.5的硼酸盐缓冲液作为运行缓冲体系。结论：1.基于离子键合及共价键合原理制备毛细管电泳EGFR酶微识别反应器。通过比较不同方法制备得到的酶微识别反应器性能,建立了共价键结合制备酶微识别反应器的方法。该方法具有普适性,可用于固定不同类型的蛋白酶,所制备的反应器稳定有效。2.以激活的EGFR作为固定酶,ATP作为底物,吉非替尼作为已知抑制剂,苯丙氨酸作为阴性对照证实EGFR酶微识别反应器可用于TKI识别筛选。3.建立了新疆紫草萘醌类提取物的毛细管电泳高效分离条件。4.利用毛细管电泳EGFR酶微识别反应器从新疆紫草萘醌类组分中筛选得到可抑制EGFR酪氨酸激酶活性的β-HIVS。5.结合共价键合法与毛细管电泳分离技术制备的分段多酶微识别反应器可用于混合物中不同组分与不同靶标酶之间的相互作用研究。