人类从未停止过对微观世界的探索和观察。光学显微镜自400多年前问世以来,经历了日新月异的演变。当今,在显微镜的结构和种类飞速发展的同时,显微观测技术也在不断创新。如何观测到更清晰的物体,如何拍摄/重建出更真实的三维影像,成了光学、生物学、信息科学等多个学科共同研究的热点。本文以基于二次相位光栅的三维显微成像系统为研究对象,以提高相位光栅的成像效率(文中的成像效率定义为相位光栅前3个(0,±1)衍射级的光能量相对于入射光总能量的比值)和光学系统的成像质量为目标,对基于二次相位光栅的三维显微成像系统的原理及光学系统设计方法、三维显微成像系统的误差分析、多阶相位光栅的成像效率分析、利用棱栅校正三维显微成像系统的色差等方面进行了系统的研究。在三维显微成像系统的原理及光学系统设计方面,以衍射原理和相位光栅的工作原理为基础,设计了一种简单易行且低成本的离轴菲涅耳透镜,即二次相位光栅。该光栅由一组周期不等的圆弧形刻槽组成,可使入射光的波前产生迂回相位,于是光栅对入射光的不同衍射级有了不同的聚/离焦能力。基于该光栅的光学系统可以作为附件,与大多数商用显微镜的CCD端口联接,实时记录样品3-9个不同深度平面的像。该技术打破了大部分现有三维显微成像技术对于光源相干性的限制,从根源上减弱了由于强入射光导致的样品光漂白和光损伤等问题。并由于其捕捉图像的实时性,尤其适用于活体生物细胞成像,避免了细胞游动过快而导致的不同时刻错误图像采集问题。为了观测到尽可能真实清晰的图像,提高相位光栅的成像效率和改善三维显微成像系统的成像质量,是本文研究的重点。为此分别针对相位光栅和三维显微成像系统进行了误差分析。首先,建立了三种典型加工误差(刻蚀深度误差、表面粗糙度和版图误差)的一维理论和仿真模型。计算结果表明,相位光栅的表面粗糙度和版图误差对各衍射级能量平衡的影响较小,但刻蚀深度误差决定了相位光栅前3个衍射级能量平衡的精度,必须严格予以控制。其次,系统分析了由二次相位光栅引起的三维显微成像系统的若干误差。研究结果表明,色差是影响光学系统成像质量的主要误差来源,必须加以校正。在提高相位光栅的成像效率方面,基于二元光学的相关原理,建立了多阶(2,4,6)相位光栅的一维数学模型。通过对不同台阶数相位光栅成像效率的分析,得到了与之对应的光栅各台阶的深度和栅距等参数的优化值,为今后相位光栅的设计提供了方向。理论计算及仿真结果表明,优化参数的4阶相位光栅,其成像效率高达90.9%,比2阶相位光栅高了4.4%；而相应的,6阶相位光栅的成像效率增益仅为4.8%。因此,制作4阶相位光栅是提高光栅成像效率的有效途径之一。其次,简述了几种相位光栅加工方法,并由于刻蚀深度的精度要求比较高(几纳米),提出了一种潜在的薄膜沉积加工方法。在提高光学系统的成像质量方面,校正色差是目前工作的重心之一。利用棱镜和光栅的组合——棱栅,通过设计其结构参数,可对一定波长范围的入射光进行较均匀的“预色散”,使得不同波长的光通过二次相位光栅后获得相同的衍射角,从而消除/减弱了色差。通过调节CCD相机的位置和一对棱栅之间的距离,开展一系列重复性实验,得到了一组优化的实验参数。并基于此,分别采用复合双色激光和白光,验证了一对平行排列的棱栅可有效地消除带宽约100nnm的色散现象。于是将一对棱栅与基于二次相位光栅的三维显微成像系统相结合,初步用于几种常见荧光团的模拟成像。实验表明,一对棱栅对各荧光团-1衍射级的色差进行了较成功的校正,提高了系统的成像质量。该技术亦适用于各种显微镜系统,且有望推广到9个平面同时成像系统的色差校正中。基于上述研究,本论文在以下方面具有创新之处：1)建立了相位光栅加工误差分析的一维理论模型,系统研究了几种典型的加工误差对相位光栅成像效率及前3个衍射级能量平衡的影响,并分析了基于二次相位光栅的三维显微成像系统的主要误差来源：2)建立了多阶(2,4,6)相位光栅的一维数学模型,分析了光栅相位轮廓的细化(增加台阶数目)对成像效率的影响,并论证了优化参数下的4阶相位光栅,可在实现前3个衍射级能量平衡的前提下,将光栅的成像效率提高至90.9%；3)提出了利用棱栅(棱镜和光栅的组合元件)校正三维显微成像系统色差的方法,提高了光学系统的成像质量。