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目的:据已有文献报道,无论在临床实验或糖尿病动物实验都清楚显示了血管新生能力下降和微血管功能受损,同时在体外实验中发现,高糖环境对维持内皮细胞完整性、促进血管新生有重要作用的内皮祖细胞(EPC)数量和功能均有影响,使其数量减少且功能下降。而且糖尿病患者体内高糖环境,能使还原性糖、醛基与各种蛋白质N端游离氨基酸间添加聚合形成糖基化终末产物(AGEs),这种被糖基化的变形蛋白质是毛细血管基底膜增厚、毛细血管受损的标志,也是导致糖尿病患者大血管及微血管并发症的病因之一。在高糖环境中,除了大分子蛋白质可发生糖化反应外,参与细胞有丝分裂以及对EPC血管新生有重要促进作用的成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)也能同还原糖发生非酶的共价结合,形成糖化成纤维细胞生长因子-2(gFGF-2),而这种糖基化作用可能是使EPC功能失调,进而影响血管新生的重要原因。因此本实验的研究目的在于,观察外源性糖化成纤维细胞生长因子-2(gFGF-2)对大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC)数量及体外生物学活性的影响,探讨gFGF-2对内皮祖细胞血管新生的影响。方法: 1.gFGF-2的制备及检测:用PBS将FGF-2配成浓度为10 ug/ml的溶液,-70℃冻存备用。试验前将FGF-2同250 mmol/L浓度的D-果糖于37℃共同培养48 h制备gFGF-2,用蛋白指纹图谱分析仪检测其糖化情况。2.骨髓EPC的分离、培养和鉴定:取大鼠骨髓,加PBS等倍稀释并混匀。沿管壁缓慢加入装有大鼠淋巴细胞分离液(1.083g/ml)的15ml离心管中。2000r/min×25min密度梯度离心后将中间的白雾层吸出并置入另一短管中,加入5倍以上体积的M199,以1500 r/min离心5 min,洗涤细胞两次。末次离心后,弃上清液,加入M199重悬细胞。以1×106/L的密度接种于加有M199完全培养液的预涂胶原的培养板中,置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。3~4d后换液,将未贴壁细胞弃之。倒置相差显微镜连续观察体外培养的EPC的形态、生长及增殖情况。将培养4d后的细胞分组,分别以FGF-2(150 ng/ml)、gFGF-2(150 ng/ml)以及空白组继续干预培养3d。用免疫组织化学和免疫荧光染色作CD34、CD133、VEGFR-2、ac-LDL和UEA-1检测来鉴定EPC并计数。3. EPC体外功能的测定:胰酶消化培养7 d的贴壁细胞,用血管生成试剂盒检测其能力;收集7 d的贴壁细胞作EPC黏附能力;用改良的Boyden小室作EPC迁移能力测定;MTT法测定EPC增殖能力;用放射性免疫法测定细胞的培养液GM-CSF,EPO和IL-8的含量。结果:1.经蛋白指纹图谱分析,重组FGF-2分子质量为16242.9 Da。然后将其同果糖共同培育48小时后其分子量出现增加,最大为17186.7 Da,将FGF-2成功糖化成gFGF-2。2.骨髓来源的EPC在体外培养时呈梭形,贴壁生长,二者均表达CD34,CD133和VEGFR-2表达,且能结合UEA-1并摄取ac-LDL,证明所培养细胞为内皮祖细胞。且计数结果显示gFGF-2组数量较FGF-2组数量减少,空白组EPC数量最少。3.EPC体外功能测定表明gFGF-2组骨髓EPC比FGF-2组明显的成血管能力降低,黏附能力降低,迁移能力降低,增殖能力减弱; EPC分泌的EPO、GM-CSF和IL-8比对照组都减少。结论:EPC在gFGF-2的作用下数量减少,体外生物学活性降低,血管新生能力减弱,推测gFGF-2可能是糖尿病患者体内血管新生功能降低的原因之一。