口腔鳞状细胞癌发病率居于恶性肿瘤第十位,居口腔颌面部恶性肿瘤死亡率首位,且其发病率和死亡率均有明显上升趋势。虽然在过去的数十年里,口腔癌的诊断和治疗取得了很大成就,但平均5年生存率仍然只有50%。为了保存器官的完整性以及减少术后外观及功能影响,美国癌症联合会（AJCC）已经将单纯放射治疗列为Ⅰ期和Ⅱ期肿瘤最佳治疗方法之一。放疗及化疗是头颈部鳞状细胞癌综合序列治疗的重要治疗手段,尤其是术前放化疗,不但能缩小原发肿瘤的体积,降低肿瘤浸润程度,而且可以降低癌旁淋巴结的受侵率,从而增加外科手术的切除率和肿瘤的控制率。尽管如此,口腔颌面部鳞状细胞癌具有中等程度的放射抗性,在根治性放疗剂量6000-7000cGy照射后,仍有部分肿瘤细胞不能被杀死,因此,积极探讨化、放疗增敏的新方法成为研究热点之一。而化学治疗在进一步提高恶性肿瘤患者生存率方面有巨大发展前景,能找到一种对肿瘤化疗敏感且不良反应小的药物,对于提高化疗效果起着决定性作用。一氧化氮（Nitric oxide,NO）作为一种重要的生物活性分子,其抗肿瘤特性已经越来越得到重视。NO参与体内一系列生理和病理条件下的生物过程,调节循环、神经、免疫等一系列生理活动,如血管扩张、血管通透性、血小板粘附和聚集、神经信号传递、宿主防御反应等,同时也参与包括肿瘤在内的病理过程,在肿瘤生物学上的作用错综复杂。综合而言,NO具有几个方面的量效效应:生理情况下,对正常细胞来说,适量水平的NO在信号转导、机体防御和抗基因突变方面有重要的生理功能,对细胞有保护作用;而在病理状态下,依赖于NO生成的浓度、时间和效应部位,不同条件下在体内具有促瘤或抗瘤两种作用。持续低浓度的NO损伤DNA,导致基因突变,诱发癌变,并通过促进肿瘤血管生长等效应促进肿瘤的生长和转移;高浓度的NO则通过产生细胞毒性和诱导细胞凋亡等途径产生抗瘤效应。内源性NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化生成,而诱导型一氧化氮合酶（iNOS）是催化精氨酸合成NO的关键酶。iNOS在肿瘤的发生、发展、转移及治疗等各个方面都起到调节作用。人类肿瘤中的iNOS表达升高主要与肿瘤的生长与转移有关,因为肿瘤组织中产生的NO水平比NO发挥细胞毒作用和凋亡诱导效应所需的NO水平至少要低1～2个数量级。从口腔粘膜癌前病变发展到鳞状细胞癌过程中,iNOS表达呈上升趋势,表明高水平NO是口腔鳞癌生长的早期条件,它作为iNOS的催化产物,通过生成有毒代谢产物介导DNA损伤;同时促进前列腺素PGE₂的合成,促进肿瘤血管生成、增加血管通透性。重度异常增生中iNOS的高表达和强染色可能是其发展为侵袭性癌的促进因素。利用NO的抗肿瘤特性来提高放疗与化疗的疗效,是肿瘤治疗的重要途径。本课题以人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113为研究对象,第一部分采用NO供体硝普钠（SNP,Sodium nitroprusside）,研究不同作用浓度下外源性NO的放射增敏及凋亡诱导作用。结果表明,SNP的细胞增殖抑制作用呈时间及剂量依赖性,对Tca8113细胞有明显的放射增敏作用,并能够使细胞周期产生G₂/M期阻滞。SNP的细胞增殖抑制作用及放疗增敏作用通过细胞凋亡而实现,可能与Caspase细胞凋亡通路有关。但采用NO供体药物,模拟体内高浓度NO的研究手段仅限于体外实验,随着NO浓度的增加,对机体的损伤也逐渐加大,可能导致严重的低血压,甚至危及生命,而且存在耐药性、全身不良反应等毒副作用,甚至可能增加肿瘤血供和供氧,有潜在的促进肿瘤生长的危险,使其应用受到一定限制。在第一部分研究工作的基础上,第二部分课题采用脂质体介导的方法将携带诱导性一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）基因的质粒导入人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113中,提供既增加NO产量,又避免发生全身毒副反应的NO供体方法,研究细胞转染方法的有效性及转染前后对细胞增殖能力的影响。研究结果显示,iNOS基因转染使Tca8113细胞稳定且高表达iNOS,增加NO含量,促进了肿瘤细胞增殖,并使细胞周期产生G₂/M期阻滞。第三部分在前两部分工作基础上进一步探讨iNOS基因成功转染后,Tca8113细胞化疗及放疗敏感性的改变及初步机理。第一部分硝普钠联合直线加速器协同诱导舌癌细胞凋亡的实验研究研究外源性一氧化氮供体SNP对人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113细胞的增殖抑制作用,以及联合直线加速器放疗的凋亡诱导作用。采用MTT法观察不同浓度和不同作用时间的SNP对Tca8113细胞的增殖抑制作用,并进行不同SNP作用浓度下的细胞周期分析。同时,对比研究单纯应用SNP,单纯放疗及两者联合应用对Tca8113细胞的凋亡诱导作用;HE染色光学显微镜下观察细胞形态学变化,Hoechest33258染色荧光显微镜观察细胞核形态学变化,DNA凝胶电泳及Annexin-V/PI双标记等分析细胞凋亡。Western blot检测Caspase—3蛋白的表达,同时采用流式细胞仪分析活性Caspase—3的表达情况。结果显示:不同浓度（0.1,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mmol/L）的SNP对Tca8113细胞均有抑制作用,但0.1mmol/L的小剂量作用12h,24h后,虽然细胞的存活率有所下降,分别为96.61%和89.64%,但和同一时间段对照组Tca8113细胞比较无显著性差异（P＞0.05）。随着浓度升高及作用时间延长,细胞存活率明显下降,大剂量的5mmol/L即使只作用12h,细胞的存活率也只有19.53%,作用24h的IC₅₀约为2mmol/L。不同剂量SNP使用后,在各个放射剂量下,细胞存活率与对照组比较均明显下降,而且呈浓度依赖性。0.5mmol/L和1mmol/L SNP剂量作用下,和对照组比较,放射敏感性分别增加了2.56和4.97倍(用IC₅₀计算)。对照组Tca8113细胞单纯采用直线加速器放疗后,其细胞存活率随放射剂量的增加而逐步降低,2Gy时为89.67%,5Gy时还有80.70%的存活率,在8～12Gy的较高剂量下,细胞存活率才开始出现明显下降,IC₅₀为9.44Gy,表现为对放射治疗相对不敏感。而2mmol/LSNP因为药物剂量较大,在单独使用下细胞存活率就已经约为50%,联合放射治疗下其细胞存活率随放射剂量的增加呈指数下降,2Gy时细胞存活率只有37.52%,而Tca8113对照组存活率达89.67%,两者之间比较有显著性差异（P＜0.001）,同样表现为较强的增敏效应。不同浓度SNP作用24h后,细胞周期发生显著变化,出现明显的G₂/M期比例增多现象,各浓度SNP作用后的G₂/M期比例与Tca8113对照组比较均有显著性差异（P＜0.05）,但各个SNP组之间G₂/M期比例比较未见明显差异（P＞0.05）,说明G₂/M期阻滞无浓度依赖性。AnnexinV/PI双标记染色实验结果显示,SNP各个浓度作用组以及SNP1mmol/L联合2Gy直线加速器放疗组早期细胞凋亡百分率与Tca8113对照组比较均有显著差异（p＜0.05）。SNP作用下,随着浓度增加,细胞早期凋亡百分率缓慢上升,各个浓度之间比较有显著性差异（p＜0.05）,表现为浓度依赖性;而SNP1mmol/L联合2Gy直线加速器放疗组早期细胞凋亡百分率最高,达到44.67%±3.50,与其它各组比较均有显著性差异（p＜0.05）,形态学观察结果及DNA琼脂糖凝胶电泳的DNA片断化均证实细胞发生凋亡。Western blot检测结果发现,Tca8113细胞没有出现Caspase-3蛋白条带,而SNP各个浓度组及SNP 1mmol/L联合2Gy直线加速器放疗组均有32KDa的Caspase-3条带,SNP 0.5mmol/L组蛋白表达较其它几组低。而流式细胞仪活性Caspase-3测定结果表明:Tca8113细胞基础Caspase-3活性很低,只有3.0%±1.83,而SNP1mmol/L组、SNP2mmol/L组及SNP1mmol/L联合2Gy直线加速器放疗组细胞的Caspase-3活性明显升高,分别达到18.91%±2.59、80.4%±5.96和92.8%±3.87,三组分别与Tca8113对照组比较,均有显著性差异（P＜0.001）,而三组之间比较也有显著性差异（P＜0.05）。实验结果提示:SNP在体外对Tca8113细胞具有明显的细胞增殖抑制效应,其细胞毒性作用表现为浓度依赖性和时间依赖性;SNP能够使细胞周期发生变化,产生G₂/M期阻滞;SNP对Tca8113细胞有放射增敏作用;其细胞毒性效应用及放疗增敏作用通过细胞凋亡而实现,与Caspase细胞凋亡通路有关。第二部分诱导性一氧化氮合酶基因转染对人舌鳞状细胞癌增殖的影响第一部分实验结果表明,外源性NO供体SNP具有细胞增殖抑制作用,对Tca8113细胞有明显的放射增敏作用。利用iNOS基因能上调iNOS蛋白的表达而且增加NO生成的原理,第二部分采用脂质体介导的转染方法将真核表达载体pCMV—iNOS转染入舌癌细胞系Tca8113,得到高表达iNOS的细胞系pCMV-iNOS-Tca,转染空白质粒的细胞系pCMV-Tca,用正常的Tca8113细胞作为对照,以Western blot方法鉴定转染效果;Griess法测定NO浓度,以鉴定iNOS基因的功能状态;倒置显微镜及HE染色进行转染前后细胞形态学观察;四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法分析iNOS基因转染对Tca8113细胞增殖的影响并绘制生长曲线;流式细胞仪检测转染前后对细胞周期的影响及计算增殖指数。Western blot检测结果表明,pCMV-Tca组和Tca8113对照组iNOS蛋白均有表达,但基础水平较低,两者表达量近似。pCMV-iNOS-Tca组iNOS蛋白表达明显上调,说明转染iNOS基因后细胞获得正常表达iNOS蛋白的功能;Griess法转染前后培养不同时间,细胞培养上清液的NO含量检测结果表明,三组细胞NO含量随着培养时间的延长都逐步升高,但pCMV-iNOS-Tca组在培养12h时NO含量就明显升高,达153.45±26.23μmol/L,而Tca8113组和pCMV-Tca分别只有28.18±7.44和34.45±9.67μmol/L,各个检测时间段都明显低于iNOS转染组,统计学检验有显著性差异（P＜0.001）,而Tca8113组和pCMV-Tca组之间各个时间段比较都无显著性差异（P＞0.05）。细胞培养上清液中NO含量增高,证明iNOS基因有分泌一氧化氮的功能,转染有效。MTT法检测细胞生长速度,结果表明:pCMV-iNOS-Tca组细胞的生长速度快于pCMV-Tca组和Tca8113组,但第1d及第2d三组之间并无显著性差异（P＞0.05）;从第3d起,pcMV-iNOS-Tca组细胞生长速度加快,与后两组比较有显著性差异（P＜0.05）。而pCMV-Tca组和Tca8113组两组细胞的生长速度相近,两组各个时间段的吸光度值比较均无显著性差异（P＞0.05）。细胞形态学观察结果显示转染前后形态学无明显改变;细胞周期检测结果表明,pcMV-iNOS-Tca组细胞与对照组Tca8113及pcMV-Tca组细胞相比较,细胞周期中G₂/M期比例显著增加,G₂/M期比例与后两组比较有显著统计学差别（P＜0.001）,说明iNOS基因能够使肿瘤细胞阻滞于G₂╱M期。而Tca8113与pCMV-Tca组细胞比较,G₂/M期比例无显著性差别。根据细胞周期分布计算出的增殖指数（PI）表明,PCMV-iNOS-Tca组细胞增殖指数明显大于后两组细胞,为78.71%,而后两组分别为54.29%和39.18%。以上结果说明,iNOS基因转染使Tca8113细胞稳定且高表达iNOS蛋白,增加NO分泌量,促进了细胞增殖,并使细胞周期产生G₂/M期阻滞。第三部分iNOS基因转染对Tca8113细胞体外化放疗增敏作用及其机制研究在前两部分研究工作的基础上,进一步探讨iNOS基因对人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113化放疗增敏作用及初步机理。实验分三组:转染iNOS基因的pCMV-iNOS-Tca组,转染空白质粒的pCMV-Tca组以及空白对照Tca8113组。采用MTT法测定转染iNOS基因前后,Tca8113细胞对顺铂、氟脲嘧啶和博莱霉素等化疗药物及直线加速器放疗的敏感性改变,Western blot检测P53蛋白、P21蛋白的表达情况。顺铂、氟脲嘧啶和博莱霉素三种化疗药物对pCMV-iNOS-Tca,pCMV-Tca和Tca8113三组细胞MTT的作用结果显示:pCMV-iNOS-Tca组在顺铂浓度为12.5μmol/ml时就显示了较强的杀伤作用,OD值明显下降,细胞存活率为66.63%,而pCMV-Tca和Tca8113组分别为81.5%和83.51%;随着药物作用浓度提高,其细胞杀伤效应更加明显,至100μmol/ml时细胞存活率只有33.47%,而pCMV-Tca和Tca8113组分别为50.79%和53.21%;pcMV-iNOS-Tca在各个浓度顺铂作用下的OD值,与另外两组比较均有显著性差异（P＜0.05）,而Tca8113对照组和空白质粒转染的pCMV-Tca组之间各个顺铂浓度下的OD值比较均无显著性差异（P＞0.05）。而氟脲嘧啶的作用效应与顺铂完全不同:各个作用浓度下,其OD值与对照组比较均无显著性差异,至80μmol╱ml的较大剂量时,pCMV-iNOS-Tca,pCMV-Tca和Tca8113组的细胞存活率分别还有57.33%、55.77%和56.61%,表现为各组对氟脲嘧啶的细胞敏感性无显著性差异。博莱霉素在小剂量的1μmol/ml作用下,三组细胞的OD值无显著性差异（P＞0.05）,而随着剂量加大,在5,10,20μmol/ml的作用浓度下,pCMV-iNOS-Tca组的OD值与同一浓度另外两组比较有显著性差异（P＜0.05）,至20μmol/ml的较大剂量时,pCMV-iNOS-Tca,pCMV-Tca和Tca8113组的细胞存活率分别只有35.74%、57.04%和57.81%,而pCMV-Tca和Tca8113组之间在各个平阳霉素作用浓度下的OD值比较均无显著性差异（P＞0.05）。与空白对照细胞和空白质粒转染细胞比较,转染iNOS细胞对顺铂、博莱霉素敏感性分别提高了(用IC₅₀比较)4.2倍和超过1.7倍,而iNOS基因转染对氟脲嘧啶敏感性无改变。直线加速器放疗的MTT检测结果显示:pcMV-iNOS-Tca组在2,5,8 Gy放射剂量下其细胞杀伤作用与同一放射剂量下的另外两组比较有显著性差异（P＜0.05）,但在12Gy大剂量作用下,pCMV-iNOS-Tca,pCMV-Tca和Tca8113三组细胞的存活率分别只有27.02%、30.01%和28.77%,三组OD值之间比较并无显著性差异（P＞0.05）。三组细胞的IC₅₀分别为5.66Gy、9.11Gy和9.05Gy,pCMV-iNOS-Tca组的放射敏感性明显提高,为pCMV-Tca和Tca8113的1.6倍。Western blot结果显示:转染iNOS基因前,Tca8113细胞无p53蛋白表达,而转染后的pCMV-iNOS-Tca组有极少量p53表达;顺铂及2Gy放射治疗后,两组细胞的p53蛋白表达均明显升高;但各组在药物及放射治疗前后均未出现p21蛋白表达。iNOS基因转染可以使Tca8113细胞对顺铂、博莱霉素的敏感性提高,但不能改变氟脲嘧啶的敏感性;iNOS基因转染还能够使Tca8113细胞对直线加速器放疗的敏感性增加。iNOS的增敏作用是通过调节细胞周期,引起G₂/M期阻滞,以及增加p53的表达而实现的。