目的:感染性疾病始终是严重危害人类健康的常见病多发病。世界范围内感染每年影响着数以千万计的人的健康与生命，在过去的十年里，感染与重症感染的发生率分别为437/10万和270/10万。而感染/重症感染而致的死亡率高达17％/26％。来自高收入国家的数据初步推断每年感染人数为3150万，重症感染人数为1940万例。更为严重的是，随着抗生素的过度应用，耐药菌株在持续增多，细菌耐药与变异株产生的速度甚至超过新型抗生素的研制与开发。抗感染治疗已经成为临床医生面临的棘手问题。此外，住院患者发生的医源性或院内感染也已成为临床工作中一个突出问题。因而，监测感染细菌的种类、感染来源、流行与耐药趋势对于感染性疾病的治疗和预防具有重要意义，对于有效预防和控制院内感染的发生及防止耐药菌株的产生与蔓延更具其特殊意义。　　沈阳陆军总院，作为一所现代化综合性三级甲等医院，不仅各科室收治的感染性疾病所占份额较大，而且，作为国内技术领先的脑外科和心血管外科收治的急重症患者、外伤或手术患者合并感染的机会也很多，且感染类型复杂。此外，细菌耐药形势也是十分严峻，例如，肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率在2014年和2015年分别波动在0.5～1.5％与0.8～1.9％之间，但是到了2016年，呈现明显上升趋势，甚至在第二季度达到了10.2％和16.5％。尤其是在急诊ICU、呼吸内科和神经外科部分手术科室及老年病例居多的干诊病房等重点科室，不断检出耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌株，成为医院感染爆发流行的重要隐患。了解本院感染细菌的种类与流行特点，清楚耐药菌株的产生与发展趋势及其不同感染来源细菌的同源性分析，不仅可为急重症感染的及时治疗提供保证，还可为医院预防和控制院内感染，切断传播流行途径提供科学数据资料，为防控策略的制定奠定基础。另外，神经外科作为沈阳陆军总医院手术量最大的外科科室，术后患者的颅内感染和术后应激状态下，肠屏障功能受损引起的炎症反应具有不同于全院整体感染流行状况的特点。为此，本文对沈阳陆军总院2014～2016年门诊和住院2万多例患者感染细菌的主要种类和流行概况进行了统计分析;对其中感染频率较高的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌四种重要细菌进行了连续3个年度12季度的流行与耐药趋势研究;对神经外科术后感染的脑脊液细菌的主要种类和流行及耐药情况进行了观察研究，对术后伴有应激性溃疡的患者肠生物屏障的状况以及早期肠内营养对肠道细菌影响进行了分析;对2016年1～3季度不同患者源、不同感染部位源及不同病房源细菌进行了追踪探讨。　　方法:　　1.患者来源及标本采集和预处理:本研究所涉及的患者均来自沈阳陆军总医院自2014年至2016年门诊和住院患者。采集的标本包括痰液、血液、引流液等。标本获取过程中没有给患者增加额外的经济和身体的负担，没有涉及伦理学问题。同时也维护了患者的知情权。标本的采集均在患者应用抗生素之前，根据感染类型及部位采集相应的标本，并遵循严格无菌操作方法收集标本。根据标本类型的不同采取相应的常规预处理方法。如，血液标本抗凝处理;痰液标本经液化离心收取沉淀物;引流液或尿液标本进行离心浓缩;其它组织液或分泌物尽可能低温和保鲜等。　　2.细菌分离培养及分纯:所有临床标本接种在相应培养基，35℃环境进行培养18～24小时，次日进行观察，挑取培养基上可疑的病原菌菌落进行传代分纯，再次进行35℃环境培养18～24小时。　　3.细菌的常规鉴定及药敏试验:将3ml无菌盐水加入到清洁塑料管中，用无菌接种棒挑取血琼脂培养基或中国蓝琼脂培养基上的菌落接种至盐水管中，用已校正的Vitek2比浊仪配置制备0.50～0.63麦氏单位的菌悬液。使用相应的Vitek2Compact全自动细菌鉴定系统匹配的鉴定及药敏试验板卡，按照Vitek2 Compact全自动细菌鉴定系统说明书进行上机操作。　　4.脉冲场电泳(PFGE)进行脑脊液肺炎克雷伯菌同源性检测。胶块的制备，细胞的裂解，胶块内DNA酶切，加样电泳，PFGE条带的解释，参见Tenover提出的标准。　　5.D-乳酸、血清肠型脂肪酸结合蛋白、血二胺氧化酶、肿瘤坏死因子-α检测采用ELISA法检测，按试剂盒操作指导程序进行检测。　　6.血内毒素、血浆C-反应蛋白检测采用光学浊度法检测与免疫散射比浊法检测。　　7.随机扩增多态性分析进行同源性检测:使用DNA提取试剂盒提取DNA，根据文献设计和合成鉴定各种菌的随机引物，根据引物退火温度等特点优化PCR反应体系和反应条件，进行PCR扩增，用毛细管电泳仪法检测扩增结果。　　8.质谱鉴定与分析进行同源性检测:标本复苏，血琼脂培养基培养处理后，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)分析鉴定，使用系统软件MALDI Biotyper对图谱进行聚类分析，绘制表明亲缘关系的聚类树状图，进行菌株的亲缘性分析。　　9.16S rDNA全序列鉴定进行同源性检测。细菌基因组DNA的提取，PCR扩增，取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。　　8.统计分析:应用NTSYSpc2.1软件的SAHN对毛细管电泳进行upgma聚类分析。聚类分析的结果通过Cophenetic correlation评估聚类结果。应用质谱鉴定系统软件MALDI Biotyper将得到的指纹谱图和数据库中各种已知微生物的标准指纹图谱按照匹配程度进行。16S rDNA全序列鉴定结果用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI ribosomal RNA sequence(Bacteria and Archaea)数据库中的数据进行比对，得到与待菌种序列相似性最大的菌种信息，即为鉴定结果。　　结果:　　1.病例与标本采集:2014年1月～2016年12月于沈阳陆军总院共收集标本21609例，其中男性11057例，女性10552例，平均年龄为53±12.55岁。住院患者20540例，门诊1069例。　　2.分离菌株数量与菌株来源:剔除同一患者同一部位重复分离菌株，共分离到肺炎克雷伯菌2939株，鲍曼不动杆菌2979株，铜绿假单胞菌2609株，金黄色葡萄球菌1259株，大肠埃希菌1751株，嗜麦芽窄食单胞菌711株，屎肠球菌770株;表皮葡萄球菌809株。　　3.四种重要细菌的流行病状况:流行的季节性分布，2014～2016三年来全医院检出感染细菌种类与数量见论文一图1～12。三年的12个季度中，检出率位于前三位的革兰氏阴性细菌均为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌。平均检出率分别为13.8％，13.6％，12.1％;革兰氏阳性细菌第一位是金黄色葡萄球菌，平均检出率为5.8％。肺炎克雷伯菌在2014年第3季度和2015年4季度的检出率分别为当年最高，为19.5％和14.6％，2014年第3季度检出比例与其他菌相比排在第一位;与肺炎克雷伯菌相似，铜绿假单胞菌同样在2014年第3季度和2015年4季度的检出率增加显著，分别为17.5％和11.8％，2014年第3季度检出比例也是3年12季度中铜绿假单胞菌检出率最高的;同时发现，2014年第3季度和2015年4季度痰标本占比也是同年度最高的，分别为58％和59％;鲍曼不动杆菌2014年第4季度检测数量略有下降，为212株，而2015年4季度检出数量最多为366株，占比3年来差异不显著，波动在12.5～14.7％之间;金黄色葡萄球菌在2014年第4季度检出数量在3年12个季度中最多，为150株，检出比例也最高，为8.1％。耐药及耐药趋势分析结果见论文一图13～22，表1～10。肺炎克雷伯菌耐药率最低的亚胺培南和美洛培南两种药物的耐药趋势2016年显示明显增高趋势，第二季度达到10.2％和16.5％。鲍曼不动杆菌2014年耐药率最低的是复方新诺明，但仍为46.1～68％，2015、2016年耐药呈上升趋势，波动在58.9～79.2％之间。2015～2016年增加几种检测新药包括替加环素、环丙沙星、庆大霉素、氨曲南、头孢唑啉、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢曲松、妥布霉素，其中效果最好的替加环素的耐药率最低，为1.6～7.6％之间。铜绿假单胞菌的耐药率最低，敏感率最高的是阿米卡星，耐药率波动在7.1～14.8％之间，敏感率波动在84.5～90.2％之间。金黄色葡萄球菌在三年期间的耐药程度比较稳定，对利奈唑胺和万古霉素的敏感性始终为100％，对利福平的敏感性也非常高，波动在87.4～97.8％。　　4.神经外科术后颅内感染脑脊液分离菌株流行状况:送检3369人份，阳性标本198人份，阳性率5.88％。前四位分别是鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌。鲍曼不动杆菌对大多数抗生素均高度耐药，对替加环素和阿米卡星敏感率较高，为92％和91％。表皮葡萄球菌敏感的抗生素种类较多，特别是万古霉素、利奈唑胺、替加环素敏感率为100％。肺炎克雷伯菌对多数抗生素耐药率较高，碳青霉烯类抗生素（亚胺培南与美罗培南）耐药类也不低，接近20％，阿米卡星耐药率最低，为9.5％。铜绿假单胞菌对常用抗生素耐药率较低，头孢他啶和头孢吡肟为6.2％，而碳青霉烯类抗生素（亚胺培南与美罗培南）耐药类达到了30％。　　5.脑脊液肺炎克雷伯菌PFGE分型:58株产ESBLs菌株经XbaⅠ酶切后共产生30条大小不同的片段（图3），根据带型的不同可以分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N共14个类型。其中A型为流行菌株，共21株，包含5个亚型，A1型有17株，A2，A3，A4，A5各一株。B型两个亚型，B1包含7株，B2包含1株。C型为1株。D型有D1和D2两个亚型，D1有6株，D2有1株。剩余各型分别为E型4株，F型2株，G型2株，H型3株，I型2株，J型6株，K、L、M、N型各1株　　6.神经外科术后应激状态下肠生物屏障细菌移位指标分析:D-乳酸、血清肠型脂肪酸结合蛋白、血二胺氧化酶、肿瘤坏死因子-α、血内毒素、血浆C-反应蛋白水平在术后观察组高于对照组;肠外营养组高于肠内营养组。　　7.四种临床分离细菌的菌株同源性分析:患者的自然情况及菌株的来源，患者选自2016年1月至2016年9月期间在沈阳市陆军总医院住院的患者，且同时发生2个及2个以上部位感染同一种细菌的患者，共获得上述标准30例，获得血液、尿液、痰液和腹腔液标本68份。患者的性别、年龄、标本类型及获取时间、患者的基础疾病及其住院科室等信息统计结果见论文三表17。患者分别来自急诊科、神经科、普通外科、肝胆外科和干二病房等临床科室。其中男22例，女8例，基础疾病包括尿毒症、颅脑外伤、心源性休克、高热待查、黄疸、胸部贯通伤、骨折、胆道梗阻、急性脑梗、脑出血破入脑室、带状疱疹、肺炎、肝脓肿、直肠穿孔、糖尿病等。随机引物PCR扩增及聚类分析结果（见论文三图28～31）。分析的28株肺炎克雷伯菌被区分出4种谱带群，同一患者不同取材部位在同一聚类群的数量为9个，占比32.1％。血液、尿液和痰液之间肺炎克雷伯菌的同源关系比较差异不显著(P＞0.05);检测的21株鲍曼不动杆菌被分离出3种明显的谱带群，同一患者不同取材部位在同一聚类群的数量为6个，占比28.6％。血液、尿液和皮下积液之间鲍曼不动杆菌同源关系比较差异不显著(P＞0.05);观察15株铜绿假单胞菌，各菌株间亲源关系区分不明显。同一患者不同取材部位谱图相近的的数量为14个，占比93.3％;金黄色葡萄球菌可以明显分出两种不同的亲本的菌株，同一患者不同取材部位谱图相同，不同的两名患者感染的菌亲源关系较远。质谱分析与鉴定结果（见论文三图53～70，表18～22）:28例肺炎克雷伯菌大致区分了3个种群，同一患者不同取材部位在同一聚类群的数量为26个，占比92.9％，21株鲍曼不动杆菌中除样品B-8-E03、B-2-L01和B-1-M04与其他18株菌的同源性差异较大外，大部分有极高相似度;铜绿假单胞菌质谱结果14例菌株区分了两个种群，同一患者不同取材部位的菌型相似度极高;金黄色葡萄球菌的4例样本，同一患者不同取材部位谱图相同。　　8.不同科室间患者感染菌株的同源性:肺炎克雷伯菌的随机引物扩增和质谱鉴定结果一致，不同科室内检测到的致病微生物没有高度同源性;鲍曼不动杆菌的随机引物扩增和质谱鉴定结果一致，不同科室内检测到的致病微生物也没有高度同源性;铜绿假单胞菌的随机引物扩增和质谱鉴定结果大多数科室结果一致，急诊科的5株样品聚类结果有所差异;金黄色葡萄球菌的质谱鉴定结果和随机引物扩增结果表明科室内部感染的同源性很高，不同科室内之间没有高度同源性。　　结论:　　1.临床流行病学调查结果表明，沈阳陆军总院2014至2016年门诊和住院患者感染细菌最多的前三位革兰氏阴性细菌为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌;革兰氏阳性细菌第一位是金黄色葡萄球菌;感染细菌的流行季节分析证明，夏季肺炎克雷伯菌检出率较高;四种细菌的耐药性分析结果显示，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率增高，产ESBLs肺炎克雷伯菌对碳青霉烯等药物的耐药率反而较总体水平偏低，鲍曼不动杆菌的耐药性一直偏高并且有逐步上升趋势。　　2.神经外科术后颅内感染患者脑脊液流行分析显示，以革兰氏阴性杆菌为主，鲍曼不动杆菌对大多数抗生素均高度耐药;沈阳陆军总院神经外科病房存在着同源性的肺炎克雷伯菌菌株，可能会引起院内肺炎克雷伯菌感染的爆发流行。　　3.神经外科术后应激状态下肠屏障细菌移位指标结果显示，应激状态下存在肠屏障功能损伤，导致细菌移位。早期肠内营养对肠屏障功能损伤有治疗作用。　　4.不同患者及不同部位感染菌株的同源性分析发现，用随机引物扩增的方法聚类分析同一患者不同感染部位分离的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的同源性很高，用质谱方法鉴定源于同一患者不同感染部位的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的同源性较高，鲍曼不动杆菌个体感染的同源性不显著。用16S rDNA全序列鉴定提示鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌同源性很高。　　5.不同科室间感染菌株的同源性分析结果揭示，自血液科和急诊科分离的金黄色葡萄球菌在科室内部表现高度同源性，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌在科室内同源性较低。