中国对虾作为中国沿海区域主要的对虾养殖品种,其味道鲜美、营养丰富,受到广大消费者的喜爱。但由中国对虾引起的过敏案列也日益增多,而现阶段对其过敏性研究,仍处于起步阶段。过敏影响人体健康,甚至危害生命,故探究对虾过敏原致敏机制对过敏的预防和治疗都有重要意义。在已鉴定中国对虾主要过敏原为原肌球蛋白的基础上,本文进一步深入研究,在氨基酸分子层面结合其结构探查其致敏机制,主要通过生物信息学方法预测原肌球蛋白的表位,多方法筛选抗原多肽,预测其关键氨基酸并建立空间模型。在此基础上,利用糖基化法消减蛋白和表位多肽的过敏原性。主要内容如下:1、利用生物信息学软件DNAstar和AntheProt,结合三种在线预测生物学网站,分析中国对虾主要过敏原(原肌球蛋白)的氨基酸序列,综合预测出12条潜在抗原表位并用Fmoc法固相合成。通过icELISA法和dot-blot法,借助30位对虾过敏患者的特异性血清,筛选出10条与血清呈现高的亲和力的表位多肽。2、通过生物信息学分析原肌球蛋白的氨基酸序列,借助SWISS-MODEL建模工具,筛选出模板野猪原肌球蛋白1clg。用软件PyMOL修改模板氨基酸序列,得到中国对虾原肌球蛋白的空间构象模型,并用VMD软件分析模板的拉式构象图,结果显示建模模板合理。从模型构象中可以看出,中国对虾原肌球蛋白构象以α-螺旋的二级结构为主,没有复杂的三级和四级结构。蛋白不具有形成构象表位的条件,多肽为线性表位且暴露在外侧。本文利用软件BioEdit分析蛋白质氨基酸和表位中氨基酸的出现频率,同时用软件Vector NTI对比中国对虾原肌球蛋白和SDAP数据库中过敏食物原肌球蛋白的氨基酸序列,分析其保守性,综合两种方法分析得出潜在的表位关键氨基酸。以多肽T-03、T-07和T-12为例,将表位中潜在关键氨基酸突变为丙氨酸,并进行固相合成。用icELISA法借助血清分析突变后多肽的过敏原活性变化,结果显示突变肽T-03中的D、T-07中的D、E和T-12中的E,与抗体IgE结合程度明显下降,说明这几个氨基酸为各自表位中的关键氨基酸。3、利用核糖、低聚半乳糖、低聚壳聚糖对原肌球蛋白和抗原表位进行糖基化,可显著消减其过敏原活性。而蛋白、抗原表位与麦芽糖糖基化后的产物则无明显的免疫原活性变化。借助ELISA法、圆二色谱法及有效赖氨酸含量测定,对三种糖糖基化后产物进行检测分析。结果显示,在糖基化反应20 min-4 h时,蛋白糖基化产物与血清IgE的结合能力无明显变化;8h-12h时,糖基化产物与血清IgE的结合能力有所下降,说明过敏蛋白的免疫原活性减弱。抗原多肽在20 min-2h时,过敏原性无明显变化;4-12h时,多肽过敏原性减弱。二级结构分析显示,原肌球蛋白核糖糖基化产物α-螺旋结构下降了 13.79%,低聚半乳糖糖基化产物α-螺旋结构下降了 10.47%,低聚壳聚糖糖基化产物α-螺旋结构下降了10.34%。多肽与低聚半乳糖、低聚壳聚糖糖基化产物,α-螺旋结构也呈现下降趋势,核糖作用糖基化后产物则无规律性变化。原肌球蛋白的赖氨酸含量有明显的下降趋势,多肽的有效赖氨酸含量则无明显的变化规律。4、利用血清IgE介导人源肥大细胞脱颗粒释放模型,分析检测原肌球蛋白和抗原表位的过敏原性。抗原最低浓度1ug/mL时,肥大细胞进行脱颗粒。组胺、类胰蛋白酶和β-己糖胺酶是检测肥大细胞脱颗粒的主要指标,其结果显示有10条多肽为过敏原,同icELISA和dot-blot检测结果一致,且以多肽T-03、T-07和T-12释放量最多。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、细胞趋化因子(IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8)和脂类物质(前列腺素和白三烯)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)等在细胞脱颗粒时,含量都有增加。本文还检测IgE受体(FcεR1)的mRNA表达情况,证明了对虾过敏是IgE介导的过敏反应。同时观察肥大细胞脱颗粒电镜图,能明显看到细胞形态已经破坏,细胞核破碎、细胞膜破裂通透,有颗粒物质释放到细胞外,有部分颗粒物呈现明显的中空状态。