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目的γδ T细胞发挥杀伤活性时不需要特异性抗原的刺激,无主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）限制性,具有较好的抗肿瘤活性和多种生物学功能,是肿瘤细胞免疫治疗强有力的工具。有研究表明,利用体外扩增的γδ T细胞治疗多种实体瘤取得了较好的治疗效果,但使用不同方法扩增的γδ T细胞抗肿瘤活性存在较大差异,直接影响其临床治疗效果。因此,建立和优化γδ T细胞体外培养方法,获得可用于临床治疗的、高抗肿瘤活性的γδ T细胞具有重要意义。本研究将建立并优化外周血γδ T细胞体外扩增方法,评价扩增后γδ T细胞的体内外抗肿瘤活性及其安全性。方法1)收集10份健康志愿者外周血标本进行外周血单个核细胞分离。2)利用GT-T551H3培养基,添加植物血凝素（phytohaemagglutinin,PHA）、唑来膦酸、白细胞介素2（interleukin-2,IL-2）和白细胞介素-7（interleukin-7,IL-7）等细胞因子,根据γδ T细胞体外扩增的倍数及纯度等,探索最佳的细胞因子组合、浓度及添加时间等,建立γδ T细胞体外扩增工艺。3)利用优化的培养体系对外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）、经免疫磁珠分选的γδ T细胞,分别进行体外扩增,观察细胞生长状态、速度,检测扩增后γδ T细胞纯度、通过细胞计数计算细胞总数等。4)使用红色荧光染料标记A549细胞、K562细胞、SK-MES-1细胞和Ho8910细胞等靶细胞,利用体外扩增后γδ T细胞在不同效靶比的情况下进行4小时杀伤实验,采用流式细胞术检测γδ T细胞的细胞毒活性。5)利用裸鼠肺癌移植瘤模型评价体外扩增后γδ T细胞的体内抗肿瘤活性,实验组小鼠给予体外扩增后γδ T细胞治疗,对照组小鼠给予无菌PBS溶液,比较两组小鼠的肿瘤生长速度等。6)利用C57BL/6小鼠检测体外扩增后γδ T细胞的急性毒性作用,实验组小鼠腹腔注射体外扩增γδ T细胞溶液,对照组小鼠腹腔注射无菌PBS溶液,观察小鼠的生存情况及急性毒性反应等。7)利用PCR方法、体外培养等方法检测体外扩增后γδ T细胞外源性因子的污染情况;利用软琼脂克隆试剂盒检测体外扩增后γδ T细胞的克隆形成能力。结果优化后的γδ T细胞培养液为无血清培养基GT-T551 H3培养基中添加以下浓度的细胞因子:200 IU/ml IL-2、10μg/L IL-7、1.0μg/ml植物血凝素、1.0μM唑来膦酸、0.4%自体血浆。培养条件为37℃,5%CO2。体外培养1416 d后,γδ T细胞扩增倍数>1000倍,细胞总数>1.0×1010个,其中CD3+γδ TCR+细胞所占比例>90%,无细菌、真菌、支原体和病毒因子等污染。体外扩增后的γδ T细胞对肺鳞癌细胞SK-MES-1、卵巢癌细胞Ho8910、肺腺癌细胞A549和慢性髓原白血病细胞K562均具有较强的细胞毒性,杀伤效率均>65%（效靶比为50︰1）。实验组和对照组小鼠的肿瘤体积分别为（828.99±61.05）mm3和（1723.51±84.30）mm3,差异有统计学意义（P<0.05）。输注γδ T细胞的小鼠无急性不良反应。结论本研究培养的γδ T细胞具有足够的数量、高纯度、较强的杀伤活性、良好的体内外抗肿瘤活性及安全性,对肺癌、卵巢癌和白血病肿瘤细胞具有杀伤活性,达到临床应用的要求,且因其操作简单可行,可于体外进行大量扩增,具有很好的临床应用前景。