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高等植物按碳的同化反应不同可分为C3、C4和CAM类型。C4植物在长期的进化过程中形成了特有的光合相关基因,使得C4植物在高光强、高温和高氧分压条件下具有较C3植物更高的光合速率。利用转基因技术,将C4光合相关基因导入C3植物,以提高光合效率来达到提高作物产量,是主要农作物育种研究的一个热点。本研究利用下胚轴侵染和花序浸染两种方法来将农杆菌介导的玉米C4型PEPC光合相关基因导入到甘蓝型油菜中,为利用C4高光效基因提高油菜产量和品质作出初步探索。。
在下胚轴侵染方法中,对影响遗传转化的一些关键因素进行了研究。结果表明,当预培养2d,激素为1.5mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA,分化激素为4 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+5mg/L AgNO3时,愈伤组织诱导率达到最大,愈伤组织质量最好。加了GA3愈伤容易形成白色致密组织,不易分化。NAA和6-BA比例过高,容易造成根的分化而抑制芽的分化。在OD600为0.3-0.5的菌液中浸染30s,卡那霉素由第一次筛选浓度5mg/L逐渐提高到有10mg/L,出现绿色的抗性愈伤组织最多。将愈伤组织继代,并转入分化培养基,得到抗性苗,将抗性苗转入生根培养基,获得可能的转基因植株六株。最后通过分子标记法检测到两株转基因植株。
在花序浸染方法中,在适宜条件下,将农杆菌浸染液中加入0.05%表面活性剂Silwet-77,一周内每隔一天处理一次花序,结实率较高,当Silwet-77浓度高于0.1%,后代结实率下降,且没有得到转基因植株。将收获的种子分别采取浸种法和叶片喷雾法进行卡那霉素抗性筛选,而大田种植的植株以卡那霉素浓度为350mg/L进行叶片喷雾法,连续喷洒3-4天进行筛选。经过初步筛选的植株再通过分子标记检测共获得五株转基因植株。
将获得的七株转PEPC基因油菜进行PEPC酶活性和净光合速率的测定,结果显示转PEPC基因油菜的PEPC酶平均活性比原种提高了17倍左右,净光合速率比原种提高了15.5%,胞间CO2浓度比原种低35%,这表明PEPC基因在转油菜植株中得到了高效表达。