论文部分内容阅读
目的:研究母亲孕前、妊娠期及哺乳期暴露于尼古丁对子代小鼠海马神经发生的影响,发现发育早期尼古丁暴露通过小胶质细胞影响青春期海马神经发生的作用机制,探究发育早期尼古丁暴露通过CX3CL1/CX3CR1信号通路促进子代海马新生神经元的增殖并降低其存活率的作用机制。方法:1.购7周C57BL/6雌鼠(n=12)及雄鼠(n=4),购买后适应两周。雌鼠分为尼古丁暴露组(NIC组,n=6)及糖精钠对照组(control组,n=6),雌雄3:1配对。雌鼠在孕前2周,孕期及哺乳期(产仔21内)分别自由饮用200μg/ml尼古丁(1%糖精钠配制)及1%糖精钠溶液。仔鼠出生第7、8、9(P7、P8、P9)三天进行翻正实验。出生20天后,仔鼠与母鼠分离,不再接触尼古丁,雌雄分开饲养。仔鼠出生第35天,一部分用于行为学检测(旷场实验),另一部分用于海马神经形成与新生神经元存活实验(BrdU注射)。2.对第35天仔鼠(P35)进行BrdU注射,分为增殖组和存活组。增殖组雌雄仔鼠腹腔注射100mg/kg BrdU,注射2次,相隔6小时。最后一次注射BrdU后24小时内取脑,保存于30%蔗糖溶液中。存活组雌雄仔鼠腹腔注射BrdU50mg/kg,连续注射5天。分别于最后一次注射7天和21天后取脑,保存于30%蔗糖溶液中。小鼠脑模具切海马组织,冰冻切片机行海马冠状切片,片厚40 μm,每隔12片取一片,制成系列切片。取系列切片做免疫组织荧光化学染色。共聚焦显微镜下观察拍照、计数海马BrdU 阳性细胞的增殖、分化及存活。3.BrdU免疫荧光化学方法检测尼古丁组与对照组青春期仔鼠(P35)海马中新生神经细胞数量、BrdU/DCX双标荧光染色检测新生神经元数量及形态,BrdU/Iba1双标荧光染色检测小胶质细胞数量等的变化,BrdU/GFAP双标荧光染色检测星形胶质细胞数量等的变化。4.Westerm blot定量分析尼古丁组与对照组青春期仔鼠(P35)海马内小胶质细胞CX3CL1、CX3CR1及下游分子PKA和p-ErK的蛋白表达水平。5.免疫荧光化学方法检测尼古丁组与对照组子代小鼠新生神经细胞存活率6.培养原代小胶质细胞及海马神经元。小胶质细胞加入10 μ mol尼古丁分别处理12h和24小时。收集上清后,使用小胶质细胞培养的上清培养海马神经元48h。收集处理后的小胶质细胞及海马神经元的蛋白。7.Westerm blot定量分析尼古丁组与对照组中小胶质细胞和海马神经元细胞CX3CL1、CX3CR1的蛋白表达水平。结果:1.翻正实验结果显示尼古丁组仔鼠翻正时间明显长于对照组仔鼠(P<0.05)。2.旷场实验结果显示尼古丁组雌性子代运动总距离少于对照组(P<0.05),中心区停留时间少于对照组(P<0.01),但是静止不动时间却长于对照组(P<0.05),雄性子代与雌性子代趋势一致,但无统计学意义。3.子代小鼠海马系列切片免疫荧光染色结果显示,尼古丁组青春期(P35)雄性和雌性子代小鼠相较于对照组新生神经元增殖增多(P<0.05),但一周存活率均低于对照组,且雌性子代有明显差异(P<0.05),三周后新生神经元大量死亡。4.BrdU/DCX免疫荧光双标结果显示,尼古丁组雄性和雌性子代在青春期时新生神经元数量均高于对照组,但仅在雌性子代中有明显差异(P<0.01)。且尼古丁组雄性和雌性子代新生神经元的错乱发生率高于对照组。5.BrdU/Iba1免疫荧光双标结果显示,尼古丁组雄性小鼠海马内小胶质细胞高于对照组(P<0.01),尼古丁组雌性小鼠海马内小胶质细胞数目明显高于对照组(P<0.001)。6.Western blot结果显示尼古丁组青春期雄性小鼠(P35)海马内小胶质细胞标记分子Iba1表达高于对照组(P<0.05),雌性小鼠小胶质细胞表达高于对照组(P<0.01)。7.Westerm blot结果显示,与对照组相比,尼古丁组雄性子代CX3CL1、CX3CR1(P<0.01)及下游分子PKA、p-ErK的表达均升高。尼古丁组雌性子代CX3CL1(P<0.01)、CX3CR1(P<0.01)及下游分子 PKA、p-Erk(P<0.001)的表达明显高于对照组。8.离体实验中,Westerm blot结果显示,尼古丁处理12小时后CX3CL1在小胶质细胞中的表达上调(P<0.05),尼古丁处理24小后也明显高于对照组(P<0.01)。与未处理尼古丁细胞相比,CX3CR1在小胶质细胞中的表达,在尼古丁处理12小时后上调(P<0.01),在尼古丁处理24小时后表达下降。9.离体实验中,Westerm blot结果显示,与对照组相比,CX3CL1在原代神经元中的表达在尼古丁处理12小时、24小时后逐渐降低。CX3CR1在原代神经元中的表达在尼古丁处理12小时后明显降低(P<0.05),尼古丁处理24小时后略有升高。结论:本研究发现母亲来源的尼古丁仔鼠在行为学上表现为出生后发育早期神经发育迟缓,长期慢性生命早期尼古丁暴露并撤除后,青春期子代自发活动与探索行为低于对照组,焦虑水平高于对照组。青春期海马区新生神经元数量在一段时间内增多,排列错乱,随后大量减少,存活降低。海马小胶质细胞数目应激性增加。说明母亲孕期及哺乳期暴露于尼古丁中会给青春期子代神经发生带来不利影响,且可能是通过调节CX3CL1/CX3CR1信号通路抑制海马神经发生。图[17]表[0]参[41]