论文部分内容阅读
核苷酸还原酶是人体内催化dNTP从头合成途径的唯一限速酶，对于细胞内dNTP库的调控非常重要，而人体细胞增殖、DNA损伤修复都需要稳定的dNTP供应才能实现，精确的dNTP库调控对于细胞的正常生理活动以及基因组稳定非常重要。本论文主要进行了两个方面的工作： 核苷酸切除修复是人体细胞内进行DNA损伤修复的重要方式，而通常其中发挥DNA损伤识别功能的XPC蛋白还具有对许多基因转录的调控功能，为了探究XPC蛋白是否参与调控核苷酸还原酶基因的转录，进而发挥对dNTP库的调控作用，实验使用了XPC蛋白突变的XP-C细胞株与正常胚肺成纤维细胞MRC-5细胞株。细胞经紫外光照射处理后，通过荧光定量PCR和Western Blot方法检测核苷酸还原酶三种亚基hRRM1、hRRM2与p53R2的转录与蛋白水平，发现XPC蛋白突变的细胞中hRRM2的转录明显增加，而在正常细胞中则没有增加；此外也检测了与hRRM2的转录调控相关的Rfx1与E2F1基因的转录水平，发现E2F1可能参与了hRRM2的转录调控。最后用MRC-5细胞使用染色质免疫沉淀技术发现XPC蛋白主要通过与hRRM2的启动子结合而抑制hRRM2的转录。 银纳米颗粒作为药物及日常用品的成分应用越来越广泛，咖啡因是咖啡等饮品及多种药物的主要成分。本论文在用HeLa细胞系摸索并得到了银纳米颗粒与咖啡因共同处理的最佳条件后，使用MRC-5细胞与非小细胞肺癌H1299细胞株为材料，从分子生物学的角度探讨了银纳米颗粒与咖啡因对细胞的复合作用。实验首先验证了核苷酸还原酶亚基hRRM1、hRRM2与p53R2的转录、p53与MDM2的转录、细胞凋亡途径E2F1、Bax与Apaf1的转录、ROS消除相关的SOD1、SOD2与过氧化氢酶的转录以及与细胞周期相关的p21和CyclinD1的转录，发现咖啡因无论是否在银纳米颗粒的存在下都能抑制hRRM2、E2F1的转录，促进Bax、Apaf1、SOD1、SOD2、过氧化氢酶与p21的转录，而SOD2的转录明显是随着银纳米颗粒的浓度增加而加强。另外发现银纳米颗粒能够促进核苷酸还原酶的hRRM1和hRRM2亚基的表达，但咖啡因可以明显抑制。使用MG132处理细胞后，hRRM1的蛋白水平没有恢复，说明咖啡因对hRRM1的抑制作用并非通过蛋白酶体途径；而咖啡因对hRRM2在MRC-5细胞中的抑制也并没有因MG132的处理而回升，但对H1299细胞使用MG132处理后，hRRM2则表达量增加，这说明p53可能涉及到hRRM2的降解的调控。