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宫颈癌是最常见的、严重危害广大妇女生命和健康的妇科恶性肿瘤之一其发病率和死亡率一直居于高水平。我国每年有13.15万新发病例,约占全世界的1/3；近些年来,在全世界范围内,年轻宫颈癌患者的发病率和死亡率有明显上升的趋势,严重威胁患者生活质量和生命健康。宫颈癌的发生发展是个多因素、,多阶段、多步骤的过程,寻求与其发生发展相关的标志物,为宫颈癌的早期诊断和临床治疗提供新的思路,提高宫颈癌的诊治水平。血管新生是肿瘤生长的必要条件,肿瘤的生长和转移与组织中血管生成有着密切的关系,通过不同的途径阻断或恢复血管生成相关的调控因子,抑制肿瘤内血管生成从而抑制肿瘤的生长,成为目前抗肿瘤治疗的新思路。Neuropilin-1(NRP-1,神经纤毛蛋白-1)是Satoda等1995年首次在欧洲爪蟾神经纤维轴突上发现并报道的一种相对分子量为1.3x105的Ⅰ型跨膜糖蛋白。目前针对NRP-1的研究已经从最早的神经轴突导向逐渐扩展至血管生成、肿瘤增殖与转移、肿瘤免疫等多个方面。大量研究表明NRP-1是VEGF亚型的特异性受体,能够与VEGF165结合,同时,NRP-1作为其协同受体,能够以双倍体的形式增强VEGF165与VEGFR-2结合,加强VEGF165诱导的内皮细胞趋化性和有丝分裂原性,促进肿瘤血管增生。NRP-1也可以通过非依赖VEGF的途径发挥促进肿瘤血管生成的作用,但其具体的作用机制尚不十分清楚。Semaphorin3A (SEMA3A信号素ⅢA)是神经导向因子家族Semaphorins的重要成员之一,是具有神经生长抑制作用的跨模型或分泌型蛋白质。SEMA3A在非神经系统也广泛表达,在诱导凋亡、抑制细胞迁移、肿瘤生长等方面发挥重要作用。SEMA3A在宫颈癌中的表达及其与宫颈癌发生发展的关系国内外罕见相关报道。目前研究认为SEMA3A作为候选的潜在的抑癌基因,与多种肿瘤的发生密切相关,它能够与VEGF165竞争性结合NRP-1,抑制VEGF165介导的血管生成,抑制肿瘤的生长、侵袭和转移。目的本实验通过采用免疫组化和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测Neuropilin-1和Semaphorin3A在宫颈癌、CIN及正常宫颈组织中的表达,分析二者在蛋白水平和转录水平在不同宫颈组织中的表达差异及其与宫颈癌临床病理特征之间的关系,分析宫颈癌中二者之间可能涉及的信号通路,以及作用的相关性,从而为其临床诊断、分子生物学治疗提供新的靶点和可靠的理论基础。材料与方法1.实验对象：收集2011年5月至2012年3月在郑州大学第三附属医院门诊行宫颈活检术或住院手术治疗的宫颈标本92例,其中CIN29例,宫颈癌45例,正常宫颈18例(取自因子宫肌瘤或腺肌症行全子宫切除患者)。年龄32-65岁,平均年龄44岁,按照FIGO宫颈癌分期标准,Ⅰ期23例,Ⅱ期16例,Ⅲ期4例,Ⅳ期2例；按照宫颈癌病理学分级标准,G1级19例,G2级16例,G3级10例。32例患者无淋巴结转移,13例患者无淋巴结转移。所有标本切下后于5min内取材,严格遵循无菌术原则,一部分标本取材后迅速放入液氮罐中,然后转移至-80℃冰箱保存；一部分经10%甲醛固定后石蜡包埋,4μm连续切片。所有患者术后均经2位病理专家确诊,均排除其他肿瘤病史,无放疗、化疗及免疫治疗史。2.实验方法：采用免疫组化SP法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中NRP-1和SEMA3A的表达,探讨二者之间可能涉及的信号通路和相关性,以及与临床病理特征的关系。3.统计学方法：SPSS17.0数据包进行分析,定性资料采用χ2检验、Fisher’s确切概率法等方法；计数资料均采用x±s来表示,采用单因素方差分析、t检验、K-W检验等方法,NRP-1和SEMA3A相关性分析采用Pearson相关性分析,检验水准α=0.05结果1.不同宫颈组织中NRP-1蛋白和SEMA3A蛋白的表达免疫组化结果显示：NRP-1蛋白和SEMA3A蛋白均主要在细胞浆及细胞膜中表达,二者的阳性细胞在显微镜下观察为棕黄色染色。NRP-1蛋白在正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中阳性表达率逐渐升高,分别为11.1%,44.8%,73.3%(P<0.05)。SEMA3A在正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中的蛋白阳性表达率逐渐降低,分别为94.4%,58.6%,31.1%(P<0.05)。2.NRP-1蛋白和SEMA3A蛋白与宫颈癌临床病理特征的关系宫颈癌组织中NRP-1和SEMA3A蛋白的表达与患者年龄、病理学分级、组织学分型无关(P>0.05),与临床分期和淋巴结转移有关(P<0.05)。随着宫颈癌临床分期增加,NRP-1蛋白阳性表达率逐渐增加,分别为56.5%、87.5%、100%；SEMA3A蛋白阳性表达率逐渐降低,分别为47.8%、18.8%、0%(P<0.05)。淋巴结转移组NRP-1蛋白阳性表达率为100%,高于淋巴结未转移组62.5%；淋巴结转移组SEMA3A蛋白的阳性表达率仅为7.7%,低于淋巴结未转移组40.6%,差异均具有统计学意义。3.不同宫颈组织中NRP-1mRNA和SEMA3AmRNA的表达RT-PCR结果显示：NRP-1nRNA在702bp处可见清晰明亮条带,在正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中,NRP-1mRNA表达量逐渐升高,分别为0.023±0.042,0.235±0.081,0.315±0.119(P<0.05);SEMA3AmRNA在326bp处可见清晰明亮条带,其表达量在正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中表达量逐渐降低,分别为0.448±0.118,0.105±0.074,0.052±0.043(P<0.05)。4. NRP-1mRNA和SEMA3AmRNA与宫颈癌临床病理特征的关系宫颈癌组织中NRP-1mRNA和SEMA3AmRNA的表达与患者年龄、病理学分级、组织学分型无关(P>0.05),与临床分期和淋巴结转移有关(P<0.05)。在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ宫颈癌组织中,NRP-1mRNA的表达量逐渐升高,分别为0..256±0.102、0.353±0.108、0.439±0.076(P<0.05)；相应的SEMA3AmRNA表达量分别为0.077±0.044、0.034±0.024、0.007±0.008(P<0.05)。淋巴结转移组NRP-1mRNA表达量为0.386±0.097,高于淋巴结未转移组0.286±0.116(P<0.05)；淋巴结转移组SEMA3AmRNA表达量为0.027±0.026,低于淋巴结未转移组0.063±0.045(P<0.05)。5.宫颈癌中NRP-1和SEMA3A表达的相关性免疫组化结果显示：NRP-1蛋白和SEMA3A蛋白在45例宫颈癌组织中两者均表达阳性的共7例,均表达阴性的共有5例,二者在宫颈癌组织中的表达呈负相关(r=-0.355,P=0.017)。RT-PCR结果显示:NRP-1mRNA和SEMA3AmRNA在宫颈癌组织中的表达量呈负相关(r=-0.638,P=0.001)结论1宫颈癌中NRP-1表达升高,SEMA3A表达降低促进了宫颈癌发生和侵袭转移。2NRP-1和SEMA3A相互作用共同参与了宫颈癌的发生发展。