非小细胞肺癌是全世界最致命的癌症之一。然而，可用于非小细胞肺癌的治疗选择非常有限，在美国其5年的总生存率仅有18.2％。而在我国，肺癌的发生率和死亡率呈每年上升的趋势。目前，对肺癌的治疗仍首选手术切除，对于失去手术切除机会的患者，则采取放化疗或靶向治疗的应对策略。酪氨酸激酶抑制剂（TKI），比如吉非替尼（gefitinib），在非小细胞肺癌患者中显示出良好的疗效。然而这种治疗更指向性的针对那些EGFR基因含有19和21外显子突变的非小细胞肺癌患者。更糟的是，那些最初对吉非替尼治疗敏感的患者，绝大多数最终会出现耐药现象。报道指出，吉非替尼继发耐药的机制约有50%与 EGFR的二次突变（主要为T790M突变）有关，而约有22%与c-Met基因的扩增相关。而其它诸如HER2基因扩增，K-Ras基因突变，PTEN的缺失等都曾被报道过与原发性或者继发性TKI耐药发生相关。虽然TKI治疗的耐药患者与日俱增，目前与之相应的对策却捉襟见肘。　　PI3K信号通路在非小细胞肺癌的发生发展中，以及TKI耐药现象的发生中扮演着重要的角色。正是由于吉非替尼耐药最主要的机制，比如 EGFR基因T790M突变以及c-Met基因扩增能持续性异常激活PI3K/Akt信号通路，才导致癌细胞的增殖并抑制其凋亡。而日本约有4%的肺癌患者被检测出其编码 PI3K催化亚基p110α的PIK3CA基因带有突变。因而，目前已有许多PI3K抑制剂用于肺癌治疗的临床研究。然而，越来越多的临床实验数据表明，使用PI3K特异性抑制剂单一给药的方式治疗肺癌效果不佳。研究指出，联合 MEK/ERK与PI3K/Akt信号通路一起作为抑制剂的多重靶点会使得治疗癌症的效果更为显著。　　之前的研究认为Aurora A/B激酶抑制剂有克服并抑制非小细胞肺癌增殖和生长的能力。这提示我们也许联合抑制Aurora激酶通路和PI3K/Akt信号通路一起会是另一个克服吉非替尼耐药的有效策略。Aurora激酶家族是另一个肿瘤治疗的明星靶点。它在细胞有丝分裂期控制染色单体分离过程中具有至关重要的作用。而在恶性肿瘤中，由于 Aurora激酶的异常活化或者失调所导致的有丝分裂异常和染色体错配使得它们与肿瘤的发生紧密联系在一起。激酶 Aurora A和Aurora B在多种类型肿瘤中均有过表达现象，尤其是预后差的恶性肿瘤，这其中就包含非小细胞肺癌。　　本研究中，基于寻找治疗非小细胞肺癌并克服吉非替尼耐药的目的，我们根据超级计算机靶标激酶预测结果，在天然化合物库中筛选出一个多靶点抑制剂，即一黄酮类衍生物3,6,2,4,5-pentahydroxyflavone(36245-PHF)。我们利用多种方法，从各个层面检测此化合物在非小细胞肺癌中的抗癌效果，并系统性的分析了36245-PHF克服gefitinib敏感型和耐药型非小细胞肺癌的分子机制。　　第一章36245-PHF抑制非小细胞肺癌的锚定非依赖生长　　方法：　　1.我们利用超级计算机虚拟筛选模型寻找能够同时结合PI3K、ERK1/2、Aurora A/B的候选多靶点抑制剂。　　2.肺部正常细胞增殖能力及化合物36245-PHF毒性检测　　3.软琼脂克隆形成实验检测化合物36245-PHF对于gefitinib敏感和耐药非小细胞肺癌的锚定非依赖生长的影响。　　结果：　　1.36245-PHF具有潜在同时抑制PI3K、ERK1/2、Aurora A/B激酶的能力　　根据超级计算机模拟筛选模型，我们得到一个根据对接打分程序给出的得分由高到低排定前十的针对PI3K、ERK1/2、Aurora A/B各个蛋白的抑制剂清单，根据清单综合排名，我们找到多靶点抑制剂36245-PHF　　2.36245-PHF对正常肺成纤维细胞无明显毒性　　MTS实验结果表明，MRC5的增殖效率与36245-PHF未处理组并无显著差异。这提示，36245-PHF对肺正常细胞MRC5并不显著的细胞毒性。　　3.36245-PHF抑制多种肺癌细胞的锚定非依赖生长　　软琼脂克隆形成实验结果表明，在gefitinib敏感型非小细胞肺癌细胞株中，化合物36245-PHF在浓度为20μ M时显著抑制了该细胞的克隆形成。而在四株gefitinib耐药型非小细胞肺癌细胞株中，gefitinib对这四种耐药细胞株的克隆形成能力无任何抑制作用，而36245-PHF剂量依赖性抑制gefitinib耐药肺癌细胞的锚定非依赖生长。　　第二章36245-PHF体外抑制多种蛋白激酶的活性　　方法：　　1.36245-PHF激酶抑制谱检测。　　2. PI3K体外激酶活性实验验证化合物36245-PHF是否具有PI3K激酶抑制性。　　3. Aurora体外激酶活性实验验证化合物36245-PHF是否具有Aurora激酶抑制性。　　结果：　　1.36245-PHF抑制多种蛋白激酶活性　　结果表明，化合物36245-PHF对多个蛋白激酶家族成员都有一定的抑制活性，如Aurora蛋白激酶家族，PI3K蛋白激酶家族，Ret，PKB, PKC等。而数据显示，36245-PHF对Aurora B和PI3K p110α的激酶活性抑制最为显著。　　2.36245-PHF体外抑制PI3K p110α激酶活性　　体外实验结果显示，随着36245-PHF浓度的升高，其对PI3K p110α激酶活性的抑制呈明显的剂量依赖性。这一结果说明，36245-PHF确实能显著抑制PI3K p110α的激酶活性。　　3.36245-PHF体外抑制Aurora A/B激酶活性　　体外实验结果显示，随着36245-PHF浓度的升高，其对Aurora A/B激酶活性的抑制呈明显的剂量依赖性。这一结果说明，36245-PHF确实能显著抑制Aurora A/B的激酶活性。　　第三章36245-PHF竞争性抑制PI3K和Aurora A/B激酶活性　　方法：　　1.超级计算机模拟化合物36245-PHF与靶标蛋白的相互作用。　　2.化合物36245-PHF与Sepharose4B的偶联结合实验及体外pull down实验。　　3.化合物36245-PHF与ATP的多蛋白激酶竞争抑制实验。　　结果：　　1.36245-PHF与PI3K p110α蛋白激酶的ATP结合区域结合　　计算机模拟实验，pull down实验以及ATP竞争实验结果都证明，小分子化合物36245-PHF能与PI3K p110α的ATP结合空腔存在相互作用，能与这一结构局域结合形成复合物。　　2.36245-PHF与Aurora A蛋白激酶的ATP结合区域结合　　计算机模拟实验，pull down实验以及ATP竞争实验结果都证明，小分子化合物36245-PHF能与Aurora A的ATP结合空腔存在相互作用，能与这一结构局域结合形成复合物。　　3.36245-PHF与Aurora B蛋白激酶的ATP结合区域结合　　计算机模拟实验，pull down实验以及ATP竞争实验结果都证明，小分子化合物36245-PHF能与Aurora B的ATP结合空腔存在相互作用，能与这一结构局域结合形成复合物。　　第四章36245-PHF抑制PI3K和Aurora激酶信号通路　　方法：　　1. Western blotting检测gefitinib敏感和耐药肺癌细胞株处理36245-PHF对于PI3K激酶下游通路的影响。　　2. Western blotting检测gefitinib敏感和耐药肺癌细胞株处理36245-PHF对于Aurora激酶下游通路的影响。　　结果：　　1.36245-PHF抑制gefitinib敏感和耐药肺癌细胞内PI3K/Akt信号通路的活化　　Western blot结果表明，36245-PHF能显著抑制所有细胞株PI3K激酶下游信号Akt、P70S6K及 S6激酶的磷酸化活化。这提示，不论是敏感型非小细胞肺癌细胞株中还是耐药型非小细胞肺癌细胞株，36245-PHF能够抑制其细胞内PI3K/Akt信号通路的活化。　　2.36245-PHF抑制gefitinib敏感和耐药肺癌细胞内Aurora激酶信号通路的活化　　Western blot结果表明，36245-PHF能显著抑制所有细胞株Aurora激酶底物Histone H3的磷酸化活化。这提示，不论是敏感型非小细胞肺癌细胞株中还是耐药型非小细胞肺癌细胞株，36245-PHF能够抑制其细胞内Aurora激酶信号通路的活化。　　第五章：36245-PHF抑制非小细胞肺癌细胞的体内瘤体生长　　方法：　　1. gefitinib耐药肺癌细胞株A549裸鼠异种移植瘤模型检测化合物36245-PHF抗癌效果。　　2. gefitinib敏感肺癌细胞株HCC827裸鼠异种移植瘤模型检测化合物36245-PHF抗癌效果。　　3.免疫组化检测gefitinib耐药肺癌细胞株A549裸鼠异种移植瘤模型肿瘤组织增殖标志Ki-67，Akt和Histone H3磷酸化水平。　　结果：　　1.36246-PHF抑制gefitinib耐药肺癌细胞株A549裸鼠移植瘤生长　　动物模型实验结果显示，小鼠的体重并没有随着36246-PHF给药有明显的降低或波动，且肿瘤的大小受到剂量依赖性抑制。而gefitinib处理组无明显抑制。这些结果说明，36246-PHF能在体内抑制gefitinib耐药细胞的移植瘤生长且无明显毒副作用。　　2.36246-PHF抑制gefitinib敏感肺癌细胞株HCC827裸鼠移植瘤生长　　动物模型实验结果显示，与gefitinib处理组一致，小鼠的体重并没有随着36246-PHF给药有明显的降低或波动，且肿瘤的大小受到剂量依赖性抑制。这些结果说明，36246-PHF能在体内抑制gefitinib敏感细胞的移植瘤生长且无明显毒副作用。　　3.36246-PHF体内抑制增殖指标KI-67，以及Akt和Histone H3的磷酸化　　免疫组化结果显示，与对照组和gefitinib处理组相比，36246-PHF处理组， Ki-67的表达明显被抑制，且Akt Ser473和Histone H3 Ser10磷酸化水平显著下调。免疫组化的结果进一步证实了36246-PHF对A549移植瘤的生长抑制与PI3K/Akt和Aurora A/B信号通路的抑制相关。　　1.体外水平，细胞水平以及体内水平三个层面的研究结果证实，36245-PHF能以与ATP竞争的方式直接与PI3K, Aurora A或Aurora B结合在ATP结合区域上并抑制其异常激活，继而压制其下游通路信号，最终抑制gefitinib敏感型和耐药型非小细胞肺癌的生长和增殖。　　结论：　　1.体外水平，细胞水平以及体内水平三个层面的研究结果证实，36245-PHF能以与ATP竞争的方式直接与PI3K, Aurora A或Aurora B结合在ATP结合区域上并抑制其异常激活，继而压制其下游通路信号，最终抑制gefitinib敏感型和耐药型非小细胞肺癌的生长和增殖。　　2.体内免疫缺陷型小鼠动物模型实验结果与细胞水平实验结果相一致。无论是gefitinib敏感型还是耐药型非小细胞肺癌细胞株，36245-PHF均能够有效抑制癌细胞的生长和增殖，且无明显毒副作用。这为临床治疗非小细胞肺癌提供了新的治疗选择。