HIV-1融合抑制剂主要抑制病毒与靶细胞膜的融合。它以gp41亚基为作用靶点,通过抑制病毒内源性六股螺旋束(6HB)的形成,抑制病毒进入靶细胞。衍生于HIV-1gp41蛋白亚基上的C末端七重复序列(CHR)的C肽融合抑制剂主要通过与N末端七重复序列(NHR)作用,抑制内源性6HB的形成,进而抑制病毒的膜融合,其生物活性普遍较高,IC50在纳摩尔水平。T20是目前唯一上市的HIV融合抑制剂,但随着T20的临床使用,逐渐暴露出日益严重的问题:T20耐药毒株的出现;用药剂量大,治疗花费高;病人依从性差等。针对这一状况,通过对现有或衍生于CHR序列的C肽的突变,修饰,缀合等途径,探索开发出与其靶点NHR作用更强,结合更紧密,或作用在NHR上不同区域的C肽融合抑制剂。此后,虽然进一步开发了C肽融合抑制剂,如T1144,也能对T20耐药毒株具有较好的抑制作用,但其作用靶点都是NHR序列,这将导致交叉耐药的出现。因此,发现具有结构新颖,针对新靶点和新作用机制的融合抑制剂是亟需解决的难题。衍生于NHR序列的N肽融合抑制剂作用于CHR,与T20及C肽类融合抑制剂具有完全不同的作用靶点和作用机制,对T20耐药毒株有效。N肽融合抑制剂要先自聚成三螺旋体,然后再和CHR作用,N肽融合抑制剂的这些特点使得它有可能成为解决T20药物所面临问题的有效途径。但直接衍生于NHR的N肽序列较短,相互作用力弱,不具有稳定的三螺旋结构,而且在生理条件下易聚沉,导致其生物活性低,IC50只有微摩尔的水平。本文主要针对N肽融合抑制剂易聚集、生物活性低等缺点,通过对NHR序列进行修饰,氨基酸替换和异肽键交联的方法,设计出生物活性高,代谢稳定性高的N肽融合抑制剂。本文的研究主要分为两个部分:1、嵌合N肽的设计嵌合N肽是由能够形成三螺旋的人为设计肽片段与源自NHR序列能够特异性识别靶标的肽片段连接而成的肽链。针对N肽的三聚体结构不稳定、易沉淀的缺点,我们首先从头设计能够形成三螺旋的人为α-螺旋肽序列,其长度为三个或四个七重复序列(3HR或4HR),它们可以自组装成为三螺旋结构,再通过侧链形成异肽键将三条肽链交联,最终得到异肽键交联的人为设计三螺旋(3HR)3,(4HR)3。然后,在3HR,4HR的C端嵌合天然NHR肽片段N23,得到了嵌合并交联的N肽(3HRN23)3,(4HRN23)3。我们利用圆二色谱(CD),分析型超离心(sva),rp-hplc,质谱等方法确证结构和产物的正确性。经过细胞-细胞融合实验,病毒感染,代谢稳定性评价等实验,我们确证了设计的n肽(3hrn23)3,(4hrn23)3均为稳定的三螺旋结构,α螺旋达到90%以上,并且表现出高生物活性(ic50达到10nm左右)和高代谢稳定性。该部分证明异肽键交联的方法可以有效的提高螺旋结构的稳定性和n肽的生物活性。2、以天然nhr序列为模板n三螺旋肽设计上述人为三螺旋肽与n肽嵌合的设计中,人为三螺旋部分只是为了维系平行n肽三螺旋结构的形成,会造成与n肽生物活性无关的序列过长,该部分直接以天然nhr序列为模板,并通过异肽键交联的方法设计出具有稳定三螺旋结构的n肽融合抑制剂。该n肽融合抑制剂是在天然nhr序列进行尽可能少的修饰,最终得到接近天然序列的交联n三螺旋结构,以此模拟天然nhr的生物功能和作用机制,提高n肽融合抑制剂的生物活性和稳定性。本研究中,通过对天然nhr序列的部分氨基酸替换,设计出能形成三螺旋结构的n肽n36mek2,n36mek1和n36m。并在该n肽的三螺旋结构基础上,利用异肽键交联的方法,得到异肽键交联的n肽融合抑制剂(n36mek2)3,(n36mek1)3和(n36m)3。对异肽键交联前和交联后的n肽进行了结构表征和性能测定,异肽键交联的n肽(n36mek2)3,(n36mek1)3,(n36m)3具有较好的α螺旋(螺旋率80%以上)和热稳定性(tm>90℃)。它们也表现出高生物活性和良好的代谢稳定性。尤其是(n36m)3不仅序列与天然n36序列非常接近,在细胞-细胞融合实验和真病毒实验中的抑制活性达到与t20相当或高于t20活性,而且还对hiv-1流行毒株和t20耐药毒株都具有很高的生物活性。本论文共设计合成25个异肽键交联的n肽,对其中的5个n肽进行了详细的理化性质和生物性评价,确证了异肽键交联的n肽具有很高的生物活性,代谢稳定性和较低的细胞毒性,还发现异肽键的形成显著提高了n肽的α螺旋和三螺旋结构的稳定性。本论文的创新性主要表现在:1、通过对n肽的修饰和异肽键交联,设计合成出全新结构的共价交联n三螺旋肽类hiv融合抑制剂,经多种方法进行结构表征和理化性能测定,表明结果正确且达到设计目标;2、生物活性研究表明:我们设计的n肽融合抑制剂具有高活性,尤其是对t20耐药毒株同样有效。同时,具有良好的代谢稳定性,远远超过c肽类融合抑制剂。综上所述,此类抑制剂具有c肽类抑制剂不具备的特点,展现出潜在的开发前景;3、共价交联n三螺旋与天然nhr序列极为接近,可以作为c肽或小分子的分子靶标,研究其与小分子的作用机制和结构,进而为设计小分子抑制剂提供可能的结构基础。