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研究背景及目的色素障碍性皮肤病是常见的疾病,其机制复杂,对于色素性疾病,临床治疗的手段也多样化,药物治疗疗效欠佳且不良反应多。激光治疗色素的同时又易引发色素沉着。由于色素沉着的机制是皮肤美容的研究基础,因此寻找安全有效的美白剂是目前的研究热点。脂肪源性血管基质片段(SVFs)是富含脂肪来源干细胞的复合细胞成分,被证实有促进组织的再生、愈合及血管化等的能力。小鼠黑色素瘤细胞B16容易获取,生长迅速、方便培养,反复经过几代培养后,仍有较高的黑色素产生能力,并且高度同源于人的表皮黑素细胞的基因。本研究将SVFs与B16细胞共培养,观察黑色素生成及酪氨酸酶活性。并进一步制备豚鼠皮肤色素沉着动物模型,局部注射SVFs,评判SVFs对皮肤色素沉着的治疗效果。研究方法1、SVFs与B16共培养:CCK8法检测B16细胞的活性;NaOH法检测黑色素的含量;Western Blot检测酪氨酸酶表达。2、SVFs与3-异丁-1-甲基黄嘌呤(IBMX)处理的B16共培养:采用免疫细胞化学方法检测黑色素标志分子HMB-45;NaOH法测定黑色素含量;Western Blot检测酪氨酸酶表达。3、多巴氧化法测定SVFs对酪氨酸酶单酚酶的作用。4、制作豚鼠色素沉着模型,于色素沉区域注射SVFs,行组织病理染色,免疫组织化学分析,Fontana-Masson法行黑色素颗粒染色。免疫组化SP法检测诱导型一氧化氮合酶含量。结果1、SVFs与B16实验结果显示:1.1共培养能降低B16细胞的活性,降低其增殖能力。1.2黑色素的含量与对照组没有明显的差异。1.3 SVFs处理的B16细胞,tyrosinase的表达下调不明显。2、提取的SVFs与IBMX处理的B16共培养结果:2.1 HMB45在B16细胞中有较普遍的表达,IBMX诱导下HMB45的表达变强;然而,SVFs和B16细胞共培养条件下,HMB45的表达明显减少,并随SVFs量的增加呈负相关,说明SVFs有减少黑色素前体生成的作用。2.2 IBMX处理B16后,黑色素有明显的增加,与SVFs共培养后黑色素减少,且随SVFs的增加黑色素减少越明显,表明SVFs有抑制黑色素生成的作用。2.3 Tyrosinase的表达在B16细胞、B16细胞加IBMX处理以及B16细胞加IBMX处理后与SVFs共培养各组细胞中没有明显的变化2.4 SVFs有抑制B16酪氨酸酶活性的作用,随着SVFs的增多抑制效果更加明业显。3、SVFs对酪氨酸酶的单酚酶活力作用结果显示:1.25×105/mL、2.5×105/rrmL高浓度SVFs成分能延长酶反应的迟滞时间(曲线的直线部分交于横轴的值),且在相同的作用时间下,反应进程曲线均比0/mL对照进程曲线低,说明浓度为1.25×105/mL、2.5×105/mL的SVFs成分有抑制单酚酶活性的作用。而3.125×104/mL、6.25×104/mL低浓度SVFs成分则表现为消除酶反应的迟滞时间。4、SVFs体内抑制色素沉着结果显示:4.1 NB-UVB照射3次后见豚鼠皮肤形成了均匀并稳定的色素沉着,治疗完成后4周拍照可见SVFs治疗后可明显改善豚鼠皮肤的色素沉着,对照组变化不明显。4.2 HE染色可见:与对照组相比,实验组的颗粒层、棘层、角质层增厚,真皮内偶见炎性细胞的浸润,表皮黑素细胞及黑素颗粒增多,这种组织形态学改变符合紫外线照射所致的皮肤色素沉着。治疗后色素颗粒可见明显减少,基底层和棘层散在少量黑素颗粒;空白对照组色素颗粒的变化却不明显。4.3黑素颗粒合成情况评价:F-M染色可见在豚鼠正常皮肤中,表皮的基底细胞和棘层中只有少量黑素颗粒。紫外线照射后,表皮中黑色素明显增多,大量连续呈带状分布的黑素颗粒出现在基底细胞和棘层中,密集分布的黑素颗粒出现在部分的表皮全层。经治疗后,黑素明显减少,随访4周,黑素无明显复发增多。4.4免疫组化染色结果示:染色阳性细胞分布在除了角质层以外的表皮全层以及毛囊,iNOS主要分布于表皮细胞的胞浆和胞膜中。与对照组相比,照射组表皮中的iNOS的表达明显升高,治疗后实验组iNOS表达降低。结论皮肤色素沉着的致病因素复杂,治疗手段多样,色素沉着性皮肤病的治疗争议不断。SVFs在脂肪组织中储量较大、方便获取,SVFs中含有足够数量的、具有生物学活性的脂肪来源干细胞(ASCS),我们的研究结果显示SVFs与B16培养时对黑色素生成影响不大,在外界因素IBMX诱导下,SVFs能抑制酪氨酸酶活性,减少黑色素生成。进一步动物实验证实,SVFs能抑制色素沉着,治疗效果可靠。本研究有助于揭示SVFs抑制色素沉着的机理,为治疗色素性疾病提供新的突破口。