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研究背景和目的:血栓形成由血小板活化和凝血系统激活两个环节构成。蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族的原型成员PDI是该家族的主要成员。迄今,已有多项研究应用抗PDI抗体RL90以及PDI抑制剂,报道了PDI在血小板积聚和纤维蛋白形成中发挥重要作用。但是,我们近来发现抗体RL90以及PDI抑制剂对PDI的抑制作用没有特异性。而且,应用新建立的组织特异性PDI基因敲除小鼠模型,我们近一步发现血管内PDI的缺陷导致体内血小板积聚和纤维蛋白形成显著性减弱。这些新的观察结果提示,PDI对血小板活化和凝血系统激活具有双重调控作用。本课题的研究目的是明确血液和血管组织来源的PDI在血小板和凝血系统活化中的作用,解析PDI调控血小板重要受体及凝血蛋白的作用机制,尤其是判定PDI蛋白的功能域。因此,本课题为阐明血栓形成的分子和细胞机制提供新的认识,并揭示新的抗血栓形成的干预靶点。研究方法:本课题综合应用PDI重组蛋白,血小板(Pf4-Cre)特异性PDI敲除小鼠,血管壁-造血系(Mx1-Cre)特异性PDI敲除小鼠,以及通过实验筛选出的PDI全身敲除基础上转入PDI突变基因PDI(ss-oo)小鼠等多种研究工具,从生理性止血,体内血栓形成,体外血小板生理功能(包括聚集、颗粒释放、整合素?IIb?3的活化)及体外凝血酶生成等四个方面,系统地研究了PDI在血小板和凝血系统活化过程中的作用及其机制。研究结果:(1)RL90抗体能识别重组人PDI蛋白,不识别重组小鼠PDI蛋白,RL90抗体抑制ERp57蛋白酶活性,RL90抗体抑制PDI敲除血小板的聚集功能,RL90抗体抑制PDI敲除血小板的P-selectin表达和整合素?IIb?3活化;(2)Quercetin-3-Orutinoside(Rutin)抗体抑制ERp57蛋白酶活性,Rutin抗体抑制PDI敲除血小板的聚集功能;(3)重组PDI ss-ss和PDI oo-ss蛋白促进血小板聚集而重组PDI oo-oo和PDI ss-oo蛋白抑制血小板聚集,PDI oo-oo蛋白延长小鼠尾巴出血时间(3.601±0.4068 v.s.7.717±1.3,p=0.0059);(4)PDI的缺失明显抑制血小板聚集(p<0.001)、整合素?IIb?3活化(p<0.05)和?-颗粒释放(p<0.05),PDI oo-ss蛋白补偿PDI缺乏血小板的聚集功能(p=0.007),β3的缺陷抑制重组PDI蛋白和血小板的结合(p=0.0162),血小板PDI的缺失明显延长小鼠尾巴出血时间(3.369±0.6597 v.s.8.00±1.013,p=0.0003)和Fe Cl3诱导的颈动脉闭塞时间(4.914±0.3113 v.s.8.846±0.8364,p<0.0001);(5)内皮-造血系PDI的缺乏不仅明显抑制血小板积聚(p<0.0001),还抑制纤维蛋白形成(p=0.033),PDI重组野生型蛋白促进组织因子介导的凝血酶的生成(p=0.0047),PDI重组突变蛋白抑制活化血小板依赖的凝血酶的生成(p<0.0001);(6)全身PDI基因敲除小鼠以及全身敲除基础上转入PDI第一活性位点突变基因小鼠(PDI oo-ss)都有胚胎致死的表型,而全身敲除基础上转入PDI第二活性位点突变基因小鼠(PDI ss-oo)可以逃脱胚胎致死的表型。应用PDI(ss-oo)小鼠模型,我们发现血小板聚集(p<0.001)、整合素?IIb?3活化(p<0.05)、?-颗粒释放(p<0.05)均受抑制,PDI(ss-oo)小鼠血小板的铺展功能相比WT血小板明显减弱(p=0.0041),Fe Cl3诱导PDI ss-oo小鼠颈动脉血栓形成,血管闭塞时间延长(p=0.0047),PDI ss-oo小鼠出血时间延长(4.142±0.675 v.s.6.896±0.733,p=0.0054),激光诱导PDI ss-oo小鼠提睾肌动脉血栓形成模型中,血小板积聚(p<0.0001)和纤维蛋白形成(p=0.0003)均受抑制;(7)体内注入第一活性功能域CGHC失活,第二活性功能域CGHC正常的PDI oo-ss蛋白能补偿Mx1-Cre/PDIfl/fl小鼠和PDI ss-oo小鼠体内血小板积聚和纤维蛋白形成的缺陷。研究结论:PDI在血栓形成和生理性止血中发挥重要作用;PDI双重调控血小板和凝血系统活化两个关键环节,其发挥作用的功能域是其第二活性位点CGHC部位;血小板和血管壁细胞均是PDI的来源。