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近年来,结核分枝杆菌的耐药疫情的日趋严重,尤其是耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现和流行,更给结核病的防制工作带来巨大的挑战。控制耐药结核病疫情的蔓延,需要有合适的诊断方法和治疗方案。结核分枝杆菌的基因突变是结核耐药性产生的分子基础,多个耐药基因突变的不断累积导致了MDR-TB和XDR-TB的产生。既往研究发现了一些抗结核药物的耐药相关基因突变：如与异烟肼耐药相关的katG和inhA基因突变；与利福平耐药相关的rp oB基因突变,与乙胺丁醇耐药相关的embB基因突变：与氨基糖苷类耐药相关的rrs、eis、tlyA基因突变；与氟喹诺酮类耐药相关的gyrA和gyrB基因突变等。随着对结核耐药相关分子机制的研究不断深入,不仅发现了更多的耐药相关基因突变,而且发展了以此为基础的分子药敏检测技术。目前对结核耐药性检测的标准方法是传统表型检测法,即传统药物敏感性试验(DST),虽然具有高灵敏度和高特异度,但是该法是以观察结核分枝杆菌生长为基础,存在耗时长、实验条件要求高,可能对实验环境和人员造成生物性危害等缺点。以基因突变为基础的快速分子药敏检测技术克服了传统DST这些不足。WHO曾推荐使用线性探针法快速检测结核耐药性,但中国仍处于实验验证阶段,且未见其应用的系统文献报告。因此,我们利用江苏流行株对GenoType MTBDRplus和MTBDRs(?)线性探针诊断试剂盒进行评价,并采用测序技术筛选其他突变位点及验证异质性耐药的存在。耐药结核的控制不仅需要及时、准确的检测方法,而且需要有效的治疗措施。尽管接受正规治疗的MDR-TB患者数量有所增加,但所占比例和完成治疗率较低,失访或信息丢失率高。既往MDR-TB预后研究的病例大多收集于WHO修改标准化疗方案之前,在中国人群中的耐药结核治疗结局的报道还很匮乏。为此,课题组收集了江苏省镇江市2009-2013年的MDR-TB和XDR-TB病例,随访其治疗结局并分析影响因素。第一部分耐药结核线性探针快速诊断方法评价[目的]评价线性探针法快速诊断耐药结核的应用价值。[方法]选择112例江苏结核分枝杆菌流行株,进行分离培养、菌种鉴定和传统DST检测,并提取细菌DNA。使用GenoType MTBDRplus和MTBDRsl试剂盒对进行利福平(RFP)、异烟肼(INH)、氧氟沙星(OFX)、卡那霉素(Km)、乙胺丁醇(EMB)五种药物的耐药性快速检测,与传统DST检测结果比较,评价其应用价值。对传统DST、GenoType MTBDRplus和MTBDRsl检测结果不确定、两种方法结果不一致、以及突变不明确的菌株,进一步使用DNA测序的方法验证。[结果]排除13株非结核分枝杆菌(NTM),纳入最终分析的菌株共计99株,GenoType MTBDRplus检测RFP、IN H耐药的灵敏度和特异度分别为100%和50%、86.11%和47.06%,检测RFP耐药中最常见突变模式为rpoBWT8缺失+MUT3出现,检测INH耐药最常见突变模式包括katGWT缺失+MUT1出现和inhAW T1缺失+MUT1出现。GenoType MTBDRsl检测OFX、Km、EMB耐药的灵敏度分别为94.74%、62.50%、58.82%,特异度分别为92.59%、98.81%、91.67%,检测OFX、Km、EMB耐药最常见突变模式分别为gyrAWT3缺失+MUT3C出现和gyrAMUT1出现、rrsMUT1出现、embBWT缺失+MUT1B出现和embBWT缺失+MUT1A出现。DNA测序还发现了rpoB504、512、513、515、516、518、522、535、562、572密码子,katG317、299密码子,inhA-26、-34位点,gyrB422、435、450、473、511密码子,rrs1491位点,eis-10位点,以及embB319、407、410密码子等少见突变。[结论]线性探针法GenoType MTBDRplus用于检测RFP耐药具有较高的灵敏度,GenoType MTBDRsl用于检测OFX耐药既有较高灵敏度也有较高的特异度,可用于对疑似耐药患者进行早期快速检测。GenoType MTBDRplus对INH耐药的检测结果与其他研究相差较大,需要进一步验证后决定是否适合推广。由于Km和EMB耐药机制未完全明确,GenoType MTBDRsl灵敏度较低、诊断能力有限,目前尚不适宜广泛应用于临床。经测序发现的新突变位点与耐药的关系仍需要进一步研究证实。第二部分耐药结核病治疗效果分析[目的]描述耐药结核病的治疗结局,分析其影响因素,为耐药结核病控制提供指导。[方法]收集2009年7月-2013年3月镇江市第三人民医院收治的,纳入全球基金结核病项目进行治疗的MDR-TB和XDR-TB患者共103人。分析患者的住院时间、治疗时间、治疗结局及影响因素。[结果]研究对象包括94例(91.26%)MDR-TB,9例(8.74%)XDR-TB,男女比例约3：1,平均年龄为50.02±13.88岁。中位耐药诊断时间为31天。中位治疗时间为730天,其中中位住院时间为62天。60岁及以上患者的治疗时间短于年青病例；XDR-TB患者的治疗时间短于MDR-TB患者。46人(48.94%)治疗结局良好,48人(51.06%)结局不良,其中10人(10.64%)死亡。XDR-TB患者不良结局发生率高于(?) MDR-TB,60岁及以上患者不良结局的发生率高于年青病例。[结论]MDR-TB患者的中位治疗时间与初始方案接近,XDR-TB患者的中位治疗时间不仅远短于MDR-TB患者,也远短于初始治疗方案；MDR-TB和XDR-TB患者总体治疗成功率仍较低,有必要研发新型抗结核药物、完善治疗方案、提高治疗依从性,以实现结核病控制规划确定的目标。