玉米赤霉烯酮壳聚糖免疫亲和柱及免疫磁珠的制备与应用

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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由镰刀菌属真菌产生的强效雌激素代谢产物,作为分布最广的真菌毒素之一,它引起了全世界各种谷物的重要病害。ZEN可以与雌激素受体结合,扰乱人体激素平衡并导致许多生殖系统疾病,如宫颈癌、乳腺癌等。因此非常有必要发展有效的ZEN净化前处理以及分析检测方法用于农产品及其制品中ZEN的检测。本研究将壳聚糖微球和壳聚糖磁珠分别与ZEN多克隆抗体偶联制备以壳聚糖微球为载体的免疫亲和柱和壳聚糖免疫磁珠,同时对他们的性能和应用前景进行了评价。主要研究内容和结果如下:1.采用自制免疫原ZEN-KLH免疫新西兰大白兔成功制备ZEN多克隆抗体,抗体的半数抑制浓度IC50为1.82 ng/mL,与其结构类似物β-ZOL、α-ZAL、β-ZAL和其他三种真菌毒素DON、OTA、AFB1的交叉反应率均小于0.8%,表明抗体具有较高的亲和性和特异性,达到了制备免疫亲和吸附剂的要求;与α-ZOL的交叉反应率高达91.9%,该抗体可以用来同时富集纯化以及检测样品中的ZEN和α-ZOL。2.采用膜乳化法制得粒径均一的壳聚糖微球,其平均粒径为109?m,粒径分布跨度Span值为1.55,与平均粒径为86.6μm,Span值为1.50的市售Sepharose4B相比,壳聚糖微球的平均粒径略大,而粒径分布则与Sepharose 4B几乎一致,说明制备的壳聚糖微球粒径均一性较好。3.将ZEN抗体与壳聚糖微球、Sepharose 4B偶联制备获得两种免疫亲和柱,性能比较评价结果显示,以壳聚糖为载体的免疫亲和柱的柱容量为6.54μg ZEN/mL凝胶,而以Sepharose 4B为载体的免疫亲和柱的柱容量为3.06μg ZEN/mL凝胶;对免疫亲和柱重复性进行评价,发现以壳聚糖为载体的免疫亲和柱的回收率为84.9%96.2%,柱间相对标准偏差(RSD)为4.5%,以Sepharose 4B为载体的免疫亲和柱的回收率为80.4%100.5%,RSD为8.6%;将免疫亲和柱配合HPLC用于实际样品(ZEN加标浓度为50μg/kg和100μg/kg)中ZEN的加标回收检测,结果表明使用壳聚糖微球为载体的免疫亲和柱时,ZEN的回收率为92.6%100.2%,RSD小于4.4%,而在使用Sepharose 4B为载体的免疫亲和柱时,ZEN的回收率为88.3%107.3%,RSD小于7.9%。4.使用水热合成法(油浴回流法)制备壳聚糖磁珠,并用环氧氯丙烷将其与抗体偶联,对壳聚糖免疫磁珠的用量与吸附时间进行优化后并对其性能和实际应用进行评价,结果显示壳聚糖免疫磁珠的最大吸附载量为42.11μg ZEN/g;对不同浓度的ZEN标准溶液进行加标回收检测时,测得ZEN的回收率为92.4%108.2%,相对标准偏差(RSD)为5.8%,结果表明其重复性较好,平均回收率高于以上两种免疫亲和柱,并且能够实现目标物质的快速净化分离(小于3 min);将其应用于实际样品(玉米粉中ZEN加标量为50μg/kg和100μg/kg)中ZEN的净化前处理中并用HPLC检测时,测得ZEN的回收率为91.7%104.3%,RSD小于2.9%。
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