原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,近年来虽然针对原发性肝癌的诊治取得了一定进展,但其术后复发、转移仍然是影响肝癌患者预后不良的重要因素。目前发现缺氧是恶性实体肿瘤,尤其是肝癌的典型特征之一,与肝癌的转移关系密切。缺氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factor, HIF)在其中扮演了重要角色。缺氧诱导因子-2α (HIF-2α)作为其中重要一员,目前相关研究较少,其在肿瘤中功能仍存争议。而硫氧还蛋白(TXN)作为一类广泛存在于生物体内的抗氧化二硫还原蛋白,在维持细胞氧化还原稳态中发挥作用,同样在肝癌转移中发挥重要功能。鉴于TXN对于HIF-1α的调控作用已被证实,而作为与HIF-1α具有很高同源性的HIF-2α,其与TXN是否存在作用联系尚无报道。本研究主要通过验证TXN以及HIF-2α在人肝癌组织中的表达,以验证二者的相互关系,以及在临床应用中的意义。然后以人转移性肝癌细胞系为模型,明确TXN对HIF-2α的调控作用,以及可能作用机制。本研究旨在从TXN与HIF-2α在肝癌中的作用为出发点,阐明肝癌发展及转移的机制,为探索肝癌诊治的新靶点提供实验证据。本研究共分为三个部分：第一部分HIF-2α以及TXN在肝癌组织中的表达及其临床意义研究目的：通过分析TXN以及HIF-2α在肝癌标本的表达情况,探索TXN以及HIF-2α的相互关系,以及与临床病理指标的相关性,明确其在肝癌发展及转移中的作用。方法：通过对两个医学中心(天津医科大学肿瘤医院和上海复旦大学中山医院)进行肝癌切除术,并且具有完整随访资料的肝癌患者的肝癌组织标本进行免疫组化染色,根据免疫组化的染色评分将所有HCC病例分成高表达和低表达组；应用统计学方法,研究TXN以及HIF-2α表达的相关性,以及二者的表达水平与病人年龄、性别、肝炎病毒标志物、肝硬化、肿瘤大小、分化、包膜、微血管侵犯、子灶等临床病理特征的关系,以及不同表达TXN以及HIF-2α对患者预后的影响。应用不同转移潜能的肝癌细胞系,以及收集天津医科大学肿瘤医院2012年10月至2013年2月间行肝切除术的肝癌组织标本16例。应用Western Blot技术,分别检测新鲜HCC组织中,及不同转移潜能HCC细胞系中的TXN以及HIF-2α的表达情况。结果：336例HCC中,TXN阴性表达85例(25.3%),低表达75例(22.3%),中等表达108例(32.1%),高表达68例(20.2%)；HIF-2a阴性表达55例(16.4%),低表达123例(36.6%),中等表达108例(32.1%),高表达50例(14.9%)。HCC中TXN表达与HIF-2a明显相关(p=0.031)。TXN表达与术前AFP水平,血管侵犯相关；HIF-2a表达与是否伴有乙肝病史,肿瘤直径以及微血管侵犯相关。高表达TXN以及HIF-2a均提示HCC患者预后不良。在HCC伴有肝外转移病例中,TXN表达明显高于不伴有肝外转移病例,二者差异有统计学意义(p=0.036)。Western Blot结果提示在HCC组织中,TXN以及HIF-2a自肿瘤组织,癌旁组织,远端肝组织大体呈现递减表达。在不同肿瘤组织中,TXN高表达多见于伴有血管侵犯者,而HIF-2α高表达多见于肿瘤直径较大者。在伴有肺转移HCC中,TXN以及HIF-2α表达均高于不伴有肺转移病例；在高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H中,TXN以及HIF-2α表达高于低转移潜能肝癌细胞系MHCC97L。结论：TXN,HIF-2α在肝癌中的表达明显相关,且其表达均与病人的总体生存情况相关,低表达意味着病人的预后较好。在伴有转移的肝癌组织,以及具有高转移潜能的肝癌细胞系中,TXN以及HIF-2α均有更高的表达。第二部分肝癌中TXN调控HIF-2α促进肿瘤增殖、预防衰老目的：本部分通过敲减TXN,验证HIF-2α的变化,以明确TXN对于HIF-2α的调控作用；以及敲减TXN后,肝癌细胞生物学功能改变。方法：构建敲减TXN的siRNA,在高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H中,利用lipofectamine2000转染,构建瞬时敲减TXN的肝癌细胞株,于转染后48h,72h收集细胞,验证TXN敲减情况；经上述方法验证,分别于转染后2天,3天后分别提取细胞蛋白,并应用Western Blot技术验证TXN以及HIF-2α的变化情况。在MHCC97H细胞系中,通过敲减TXN后,验证低氧及常氧条件下细胞增殖,克隆形成能力,细胞衰老及DNA损伤反应情况。结果：在高转移潜能MHCC97H细胞中,通过转染敲减TXN的siRNA,与正常对照组以及转入空载体的细胞相比,转染后48h,72h, TXN,HIF-2α蛋白水平较前明显下降。通过敲减TXN,在低氧及常氧状态下均导致MHCC97H细胞增生降低,克隆形成能力下降。通过敲减TXN,在常氧条件下,MHCC97H细胞中的p-半乳糖苷酶表达较正常对照组无明显变化,而在低氧状态下,MHCC97H细胞中的p-半乳糖苷酶表达较对照组明显增高。在常氧条件下,MHCC97H细胞中r-H2AX中等量表达,而在低氧状态下无表达；通过敲减TXN,常氧条件下,r-H2AX表达较对照组无明显增加,而在低氧状态下,r-H2AX表达较对照组明显增加。结论：通过敲减TXN可诱导HIF-2a表达下降。在MHCC97H细胞系中,通过敲减TXN,低氧及常氧条件下均可导致细胞增殖及克隆形成能力降低,而低氧状态下可诱导MHCC97H细胞衰老及DNA损伤反应增加。第三部分肝癌中TXN对HIF-2α调控机制研究目的：本部分通过敲减TXN,验证HIF-2α以及特异性靶基因的改变,探索肝癌中TXN对于HIF-2α的可能调控通路。方法：构建敲减TXN的siRNA,在高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H中,利用lipofectamine2000转染,构建瞬时敲减TXN的肝癌细胞株,分别于转染后2天,3天后分别提取细胞蛋白,并应用Western Blot技术验证TXN以及HIF-2α以及Oct-4的变化情况。结果：在高转移潜能MHCC97H细胞中,通过转染敲减TXN的siRNA,与正常对照组以及转入空载体的细胞相比,转染后48h,72h,TXN,HIF-2α以及Oct-4蛋白水平较前明显下降。结论：Oct-4是HIF-2α的下游靶基因之一,其表达水平受到HIF-2α以及TXN表达的影响。TXN-HIF-2a-Oct-4是肝癌发展及转移中的重要通路。