荣昌猪白细胞介素-2基因的克隆及原核表达

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猪白细胞介素-2(interleukin-2:IL-2)是猪免疫系统中重要的细胞因子,在猪抗病和免疫应答反应中占有重要地位。本实验根据GenBank上发表的IL-2基因序列(X58428)设计并合成了特异性引物,无菌采取健康荣昌猪前腔静脉血10ml(3.8%的柠檬酸钠抗凝),用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,RPMl1640培养基(含7μg/mlConA)在5%CO2条件下37℃培养24-70小时。提取培养细胞的总RNA,用RT-PCR方法扩增出约520bp的目的片段,将该片段回收并克隆到PMD18-T载体上后进行序列测定。结果表明该基因为猪IL-2基因。它包括猪IL-2基因的全部开放阅读框,编码由154个氨基酸组成的蛋白质。与GenBank上已知的猪IL-2基因相比,在405bp处有一T-C颠换,但是氨基酸并没有发生变化。与GenBank公布的猪的IL-2序列比对同源性均为99.8%,具有较近的亲缘关系。 应用DNA重组技术,将克隆的荣昌猪IL-2基因亚克隆到PET-32a(+)表达载体上,构建重组表达载体。酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用1mM的IPTG进行诱导表达重组IL-2蛋白。用RT-PCR方法检测IL-2基因得到了转录,SDS-PAGE分析表明,在相对分子质量约37kD处有明显的蛋白质表达条带,而对照组PET-32a(+)空质粒菌在此处无条带产生,该蛋白在IPTG诱导1h时没有表达,2-4h表达量分别为7.8%、18.4%、12.3%。最后用MTT法检测从包涵体中提取的蛋白质的生物学活性。实验表明PET-32a(+)能够表达IL-2融合蛋白,所获得的蛋白具有较好的生物学活性,这为利用该蛋白及其基因研制高效抗病免疫制剂和基因工程疫苗奠定了良好的基础。
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