【研究背景】乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科的原型(prototype),与包括鸭乙型肝炎病毒(DHBV)在内的其它嗜肝DNA病毒具有相似的生物学特性。共价闭合环状DNA(cccDNA)是嗜肝DNA病毒复制过程中在宿主细胞核内形成的第一个复制中间体,它的形成标志着病毒在宿主细胞内感染状态的建立和复制循环的开始,同时它还是病毒在细胞内复制过程的初始模板。由于其在肝细胞核内形成含量相对稳定的cccDNA池,而目前绝大多数临床上应用的抗HBV药物难以清除细胞内的cccDNA,因而在停止抗病毒治疗后乙型肝炎容易复发。HBV cccDNA的监测对抗HBV药物的研发和应用评价,以及慢性乙型肝炎(CHB)患者的病情监测和抗病毒疗效评估等具有十分重要的临床意义。但由于HBV cccDNA只存在于被感染细胞的细胞核内, HBV cccDNA检测需要通过肝组织活检等手段取得足量的肝组织标本才能进行,患者对此的依从性较差,导致HBV cccDNA检测在临床中的开展和推广应用受到限制。近年来有文献报道在慢性乙型肝炎患者的血清中检测到了cccDNA,并发现血清HBV cccDNA的水平与血清HBV载量和ALT水平显著相关,血清中是否出现cccDNA还与肝组织中的总HBV DNA和cccDNA水平的高低有关,还有学者发现乙肝患者拉米夫定治疗后血清HBV cccDNA呈动态下降。以上研究结果表明血清HBV cccDNA检测似乎也可以用于评价乙肝患者的病情以及抗病毒的疗效,因而给HBV cccDNA检测从实验室研究进入临床应用带来新的希望。但他们的研究结果因检测方法特异性的缺陷而倍受争议,需要通过深入的研究进行验证。本研究以我们实验室建立的一套特异、灵敏的HBV cccDNA检测技术为基础,分别以不同程度肝损伤的DHBV感染上海麻鸭和乙型肝炎患者为研究对象,探讨在外周血中检测cccDNA的可能性及相关的影响因素。本研究共分为三个部分:(一)乙肝病毒与cccDNA在血液中的清除动力学和稳定性比较研究;(二)鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒cccDNA的动态检测;(三)乙型肝炎患者血清中乙肝病毒cccDNA的动态检测。第一部分乙肝病毒与cccDNA在血液中的清除动力学和稳定性比较研究目的以HBV为对照观察HBV cccDNA在外周血中的血液动力学特征和稳定性,探讨在外周血中检测cccDNA的可行性。材料与方法①将12只1周龄上海麻鸭随机分为A、B两组,A组和B组每只鸭分别以1.2×109 copies/ml的HBV携带者血清和含1.2×109 copies/ml pBS HBV 3.6Ⅱ质粒(模拟cccDNA)的人血清1 ml颈静脉注射。在注射后0.25 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h和32 h,分别采静脉血进行HBV DNA定量检测。②将1.2×108copies/ml的HBV携带者血浆和含有1.2×108copies/ml的pBS HBV3.6Ⅱ质粒(模拟cccDNA)人血浆各50μl,分别用5 U的RQ1 DNase酶处理37℃1 h,并以未加酶处理的相应血浆为对照,观察核酸酶处理前后血浆中HBV DNA的变化。③将1.2×108 copies/ml的HBV携带者新鲜血浆和含1.2×108 copies/ml pBS HBV 3.6Ⅱ质粒(模拟cccDNA)的正常人新鲜血浆各1.5 ml分别置于37℃水浴,在水浴后4h、8h、12h、16h、24h、2d、3d、4d、5d、6d和7d,每管分别取100μl血浆进行HBV DNA定量检测。结果①HBV和pBS HBV 3.6Ⅱ质粒在鸭血液中载量的动态变化均符合单相指数衰减曲线模型。在注射后0.25～24 h内血液中均可检测到HBV和质粒(cccDNA),32 h后则未能检出。HBV和质粒(cccDNA)在鸭血液中的平均半衰期分别为4.536±0.769 h和4.511±0.791 h,二者无统计学差异(P=0.9593);②在核酸酶处理前后,血浆中的HBV颗粒无明显变化,而质粒含量则下降了两个数量级(log10)。但相同量的HBV颗粒和pBS HBV 3.6Ⅱ质粒在体外水浴4h～7d,各时点血浆中HBV颗粒和质粒(cccDNA)的量无明显变化(变异系数分别为1.05%和1.73%),同一时点血浆HBV和质粒(cccDNA)的量配对t检验也无显著统计学差异(P=0.8568)。结论HBV cccDNA在血液中的清除动力学特征和稳定性均与HBV相似,血清HBV cccDNA检测在技术上具有可行性。第二部分鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒cccDNA的动态检测目的探讨在不同程度肝损伤的DHBV感染上海麻鸭外周血中是否能检测出DHBV cccDNA。材料与方法①建立由一对跨缺口的引物和Taqman荧光探针组成的选择性DHBV cccDNA荧光定量PCR检测系统,用不同浓度的DHBV质粒(cccDNA)和纯化DHBV rcDNA验证该系统区分cccDNA和rcDNA的效率;并进一步结合PDS(十二烷基硫酸钾)-蛋白质沉淀法和不降解质粒的ATP依赖DNA酶(PSAD)的酶切法降低模板中的rcDNA背景而实现DHBV cccDNA的特异性扩增。②用DHBV强阳性鸭血清注射40只1日龄上海麻鸭,并在注射后2个月选择持续感染DHBV的上海麻鸭中的24只随机分为4组,分别以:A)D-氨基半乳糖(D-GalN)2.2 g/kg+脂多糖(LPS)100μg/kg;B)D-GalN+LPS+10 ml/kg的CCl4灌胃2次;C)D-GalN+LPS+15 ml/kg的CCl4灌胃2次,并用生理盐水处理另一组动物作为正常对照组(NC组)。在处理后不同时间点静脉抽血1ml,分别检测血清中的ALT、DHBV载量和DHBV cccDNA,最后处死动物取肝组织评价肝损伤程度,并检测肝组织中的总DHBV DNA和DHBV cccDNA。结果①选择性DHBV cccDNA荧光定量PCR检测系统能扩增103～108copies/ml的DHBV质粒(cccDNA),而以DHBV rcDNA为模板时,只有107 copies/ml以上的DHBV rcDNA才会出现弱荧光信号,该系统扩增cccDNA的效率是扩增rcDNA效率的104倍;PDS-蛋白质沉淀法抽提和PSAD酶切纯化可分别使待测样品中的rcDNA背景降低1个数量级(log10)而保持cccDNA的含量不变,二者与选择性荧光定量PCR结合检测108copies/ml以上的rcDNA均无阳性信号。②NC组鸭无明显病理改变,A组、B组和C组鸭则分别出现点状坏死至大片肝坏死的肝损伤,3组的肝损伤程度分级具有显著的统计学差异(P<0.0001)。B组和C组在实验结束时分别有1只和4只鸭死亡。NC组和A组各检测时点血清中均未检测到DHBV cccDNA;B组和C组在初次CCl4处理后12 h分别有2只和3只鸭血清中检测到DHBV cccDNA,含量在3.17×103～1.72×104copies/ml之间,在初次CCl4处理后24 h两组各有1只鸭血清中仍可以检测出DHBV cccDNA。Logistic逐步回归分析显示血清中DHBV cccDNA的检出率与肝损伤程度评分有关(P=0.0029),而与血清DHBV载量、ALT水平以及肝组织中的总HBV DNA和DHBV cccDNA含量无关。结论①由PDS-蛋白质沉淀法抽提、PASD酶切纯化和选择性实时荧光定量PCR组成的DHBV cccDNA检测方法灵敏度高,特异性好;②在肝组织发生严重损伤时,血清中可以出现DHBV cccDNA。血清中DHBV cccDNA的出现与肝组织损伤程度有关,而与血清中的ALT水平、血清DHBV载量以及肝组织中总DHBV DNA和cccDNA水平无关。第三部分乙型肝炎患者血清中乙肝病毒cccDNA的动态检测目的观察在不同肝脏病变程度的乙型肝炎外周血中能否检测HBV cccDNA。对象与方法以57例住院的乙型肝炎患者为研究对象,其中轻度慢性乙型肝炎患者(MCHB)26例,重型乙型肝炎(SHB)患者31例。MCHB组每位患者采集血清标本1次共获得26份血清标本,SHB组每位患者在病程中的不同时间采集血清1～5次共获得60份血清标本。每份血清标本分别进行HBV载量检测和HBV cccDNA检测,并同时记录各血清标本采集时间点患者的凝血酶原时间(PT)和肝脏生化学指标检测结果。结果①MCHB组有1份血清标本HBV cccDNA为阳性,SHB组有13例患者的13份血清标本HBV cccDNA为阳性,血清HBV cccDNA的含量1.25×103～4.88×104 copies/ml之间,两组患者血清HBV cccDNA的检出率有显著统计学差异(P=0.0014),但血清HBV cccDNA检测诊断SHB的灵敏度仅为41.94%,准确度仅为66.67%。②Logistic逐步回归分析显示,血清HBV cccDNA的检出率与凝血酶原时间的长短有关(P=0.0072),而与患者的年龄、性别、血清HBV载量和ALT水平无显著相关性。结论乙型肝炎患者外周血中可以检测出HBV cccDNA,它的检出率与患者肝脏病变的严重程度有关,但血清HBV cccDNA检测不是一项恰当的判断患者肝脏病变程度、发展和预后的指标,不能取代肝组织HBV cccDNA检测。