基于信号放大技术的表面等离子共振在生化分析中的应用

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本论文采用表面等离子共振技术,基于适体与靶分子的特异性识别特性,结合聚合酶,剪切酶等工具酶的循环放大作用及纳米金生物条码技术,构建了一系列的放大反应,建立了高灵敏度、高选择性检测溶菌酶,DNA,肿瘤细胞等肿瘤标志物的分析新方法,本论文的研究内容如下:1、基于靶分子聚合置换循环放大方法,将生物条码放大技术及DNA功能化的量子点放大技术相结合,设计了一种简单、高效利用表面等离子共振技术检测溶菌酶的新方法。溶菌酶作为靶蛋白质,可以与金片上的适体DNA特异性结合,打开的颈环探针与纳米金生物条码结合,将其捕获在金基底上,在聚合酶的作用下,溶菌酶被释放到溶液中,打开其它的颈环探针,实现靶蛋白质的源头循环放大,DNA功能化的量子点在流经反应池中与基底上的生物条码上的探针结合,通过金基底上结合质量的改变,达到检测溶菌酶的目的,实验中溶菌酶的检测限为1.68x10-12M,该方法新颖,简便,实现了靶蛋白质的高选择性检测。2、构建了基于滚环复制放大表面等离子共振检测靶DNA的新方法,将纳米金生物条码与滚环复制相结合,靶DNA通过碱基互补配对,将基底上的颈环DNA打开,锁扣DNA与打开的颈环DNA末端互补杂交,并在T4连接酶的作用下连接成环,向体系中加入Phi29聚合酶,实现滚环复制放大,形成的滚环长链产物中含有大量的相同序列片段,纳米金生物条码探针作为信号增强元素,通过互补杂交,将金纳米粒子捕获到检测基底上,增强SPR信号响应,实验中靶DNA检测限可达0.35 pM,该方法实现了靶DNA的快速,高灵敏度检测,在DNA等寡核苷酸的检测中有很大应用空间。3、提出了一种基于靶向激活多级循环放大表面等离子共振检测靶DNA及肿瘤细胞的新方法。信号放大体系包括等温指数循环放大、滚环复制放大及纳米金信号增强。利用聚合酶和剪切酶的协同作用,实现DNA的等温指数循环放大,并以磁性纳米粒子作为“中间体”发生滚环复制反应,磁性纳米探针作为载体能够增大滚环复制产物的负载量,利用金纳米粒子作为信号放大探针,实现了DNA及肿瘤细胞的高灵敏、高选择性检测,通过多级信号放大对靶DNA及Ramos细胞的检测限分别为9.3 aM和10个细胞。实验中反应条件温和,无毒,经济,重现性好,为肿瘤细胞的检测提供了一种新型的定性及定量检测方法,在临床诊断及生物研究中具有广阔前景。
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