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胃癌是目前世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤,其具有发病率高、死亡率高、早期诊断率较低,生存率低等特点。有许多研究表明,胃癌存在基因的表达异常,如P15、P53、FHIT、CD44等,但这些对于研究胃癌细胞特性及其耐药性方面还远远不够。ISL1(胰岛素基因增强结合蛋白1)为转录调节因子——Islet-1,其对胰岛细胞成熟、增殖和分化都具有重要作用。我们前期有研究,通过高通量的实验技术,发现ISL1在胃癌侧群细胞中高表达。我们用RNA干扰的方法抑制ISL1在胃癌BGC823中的表达,来检测胃癌细胞的特性发生何种变化,为胃癌的治疗提供更好的理论依据。第一部分下调ISL1的表达对胃癌BGC823特性的影响目的：构建针对人胰岛素基因增强结合蛋白1(ISL1)的小干扰RNA,将小干扰RNA转染进BGC823细胞中,下调ISL1的表达,来检测胃癌细胞特性的变化。方法：从NCBI数据库中获取人ISL1基因编码序列全长,利用siRNA设计软件设计1对干涉靶点和随机的不靶向任何基因的阴性对照。将小干扰RNA转染体外培养的人胃癌细胞系BGC823,逆转录酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western-blotting)等生物化学技术,检测ISL1基因的mRNA和蛋白表达水平的变化。并用MTT比色法测定细胞增殖。用CCK-8法检测细胞对化疗药物的敏感性。结果：1小干扰RNA序列：ISL1-siRNA序列为：5’-GCUCCAAGGUGUAUCACAUTT-3’(正义)5’-AUGUGAUACACCUUGGAG-3’(反义)。阴性对照序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(正义)5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(反义)。GAPDH阳性对照序列为：5’-GUAUDACAACAGCCUCAAGTT-3’(正义)5’-CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT-3’(反义)。2测定转染后ISL1基因在胃癌BGC823细胞中mRNA及蛋白表达情况。2.1ISL1mRNA在胃癌BGC823细胞中表达下降。经半定量RT-PCR分析,ISL1siRNA下调ISL1mRNA的表达,使其表达明显减少。经过ISL1siRNA转染BGC823细胞24h后与空白对照组相比,ISL1mRNA表达水平分别为(0.658±0.032)和(1.371±0.022),差异具有统计学意义(P<0.05)。2.2ISL1蛋白在胃癌BGC823细胞中表达下降经Western-Blot检测ISL1蛋白发现,经过ISL1siRNA转染48h后与空白及阴性对照组相比,ISL1siRNA组ISL1蛋白表达水平(0.900+0.133)较空白组(1.710+0.150)及阴性对照组(1.630+0.126)减少,相比具有显著性差异(P<0.05)。3MTT比色法测定细胞的增殖通过检测各组细胞各个时间点的OD值,以培养时间为X轴,对应的OD值为Y轴,得出细胞生长曲线,结果表明siRNA-BGC823细胞的体外增殖能力明显低于其余两组细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。4CCK-8法检测细胞对化疗药物的敏感性经过PTX、5-Fu、VP-16三种药物分别作用48h后,BGC823细胞的耐药存活率分别为44%、57%、61%；而siRNA-BGC823细胞的耐药存活率分别为26%、39%、43%。结果表明,siRNA-BGC823细胞对化疗药物的敏感性明显高于BGC823细胞(P<0.05)。结论：构建针对人ISL1的siRNA,成功转染胃癌BGC823细胞,经鉴定能明显抑制ISL1mRNA及蛋白的表达。ISL1表达下调可明显抑制胃癌BGC823细胞的生长增殖速度,并增强其对化疗药物的敏感性。表明ISL1基因对胃癌细胞的生长增殖及耐药性方面有着重要影响。第二部分富集BGC823侧群细胞，观察下调ISL1对其特性的影响目的：用无血清悬浮培养法分离BGC823中的侧群细胞，检测BGC823细胞及其侧群细胞在增殖及药物敏感性方面的变化。将小干扰RNA转染至BGC823-SP细胞，下调ISL1的表达，来观察胃癌干细胞特性的变化。方法：无血清悬浮培养法富集BGC823侧群细胞，用MTT法及CCK-8法检测其在增殖及药物敏感性方面的变化。将小干扰RNA转染至BGC823-SP细胞，逆转录酶链式反应（RT-PCR）和免疫印迹法（Western-blotting）等生物化学技术，检测ISL1基因的mRNA和蛋白表达水平的变化。并用MTT比色法检测细胞增殖。用CCK-8法检测细胞对化疗药物的敏感性。结果：1成功富集BGC823侧群细胞（BGC823-SP）2BGC823及BGC823-SP细胞的增殖速度及对化疗药物敏感性的对比2.1MTT比色法测定BGC823及BGC823-SP细胞的细胞增殖的对比通过检测各组细胞各个时间点的OD值，以培养时间为X轴，对应的OD值为Y轴，得出细胞生长曲线，结果表明BGC823-SP细胞的体外增殖能力明显强于BGC823细胞，差异有统计学意义（P<0.05）。2.2CCK-8法测定BGC823及BGC823-SP细胞对化疗药物的敏感性经过PTX、5-Fu、VP-16三种药物分别作用48h后，BGC823细胞的耐药存活率分别为44%、57%、61%；而BGC823-SP细胞的耐药存活率分别为56%、67%、70%。结果表明，BGC823-SP细胞对化疗药物的敏感性明显低于BGC823细胞（P<0.05）。3测定siRNA转染后ISL1基因在胃癌BGC823-SP细胞中mRNA及蛋白表达情况。3.1ISL1mRNA在胃癌BGC823-SP细胞中表达下降。经半定量RT-PCR分析，ISL1siRNA下调ISL1mRNA的表达,使其表达明显减少。经过ISL1siRNA转染BGC823细胞24h后与空白对照组相比，ISL1mRNA表达水平分别为(0.403±0.001)和(1.428±0.302)，差异具有统计学意义（P<0.05）。3.2ISL1蛋白在胃癌BGC823-SP细胞中表达下降。经Western-Blot检测ISL1蛋白发现，经过ISL1siRNA转染48h后与空白及阴性对照组相比，ISL1siRNA组ISL1蛋白表达水平(0.592±0.187)较空白组(1.847±0.193)及阴性对照组(1.700±0.165)减少，相比具有显著性差异（P<0.05）。4MTT比色法测定细胞的增殖通过检测各组细胞各个时间点的OD值，以培养时间为X轴，对应的OD值为Y轴，得出细胞生长曲线，结果表明siRNA-BGC823-SP细胞的体外增殖能力明显弱于BGC823-SP细胞，差异有统计学意义（P<0.05）。5CCK-8测定细胞对化疗药物的敏感性经过PTX、5-Fu、VP-16三种药物分别作用48h后，BGC823-SP细胞的耐药存活率分别为56%、67%、70%；而siRNA-BGC823-SP细胞的耐药存活率分别为20%、31%、33%。结果表明， siRNA-BGC823-SP细胞对化疗药物的敏感性明显高于BGC823-SP细胞（P<0.05）。结论：胃癌BGC823-SP细胞的体外增殖能力及其耐药性远远高于BGC823细胞，用针对人ISL1的siRNA，转染胃癌BGC823-SP细胞能明显抑制其增殖，并增加其对化疗药物的敏感性。说明ISL1对胃癌BGC823的生长增殖及对化疗药物的敏感性影响很可能是通过对其干细胞的调控来实现的，其具体机制有待进一步深入研究。