【摘 要】
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黑根霉(Rhizopus nigricans)属于接合菌亚门的根霉属,菌丝无隔,细胞壁成分复杂,制备原生质体较为困难且研究较少阻碍了对其进行转化改造。本实验尝试了不同酶和各种酶解缓冲
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黑根霉(Rhizopus nigricans)属于接合菌亚门的根霉属,菌丝无隔,细胞壁成分复杂,制备原生质体较为困难且研究较少阻碍了对其进行转化改造。本实验尝试了不同酶和各种酶解缓冲液组合优化黑根霉原生质体的制备,电击转化转入pEGFP-C1质粒,利用绿色荧光蛋白(GFP)的表达对其进行筛选。电击转化法较为复杂,为了建立快速便捷的黑根霉转化体系,我们又设计了利用脂质体包埋法进行转化。实验结果如下：1.经反复试验制备原生质体的最佳条件为：0.1g鲜嫩菌丝,1m1 2%溶壁酶溶于0.6M甘露醇渗透压稳定剂的酶解液,30℃水浴四小时。2.采用电击转化法转入pEGFP-C1,原生体再生后,通过荧光显微镜及分子手段进行筛选,结果证明GFP基因得到表达,转化效率：5.91个/μ g。传到第四代发现丢失GFP基因,目前原因尚不太清楚,需要进一步研究。3. 采用脂质体转化转入pEGFP-C1,通过荧光显微镜及分子手段行筛选,结果证明GFP基因得到表达。转化效率；8.19个／μg。传代稳定没有发生基因丢失。脂质体转化作为黑根霉转化的新技术,此方法快捷稳定,为以后研究提供了基础。利用GFP可以高效筛选转化子,构建实用的黑根霉工程菌。
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