实验目的　　用生物信息学方法分析刚地弓形虫尿苷磷酸化酶（TgUPase）基因编码蛋白。对TgUPase基因进行克隆、表达，纯化重组TgUPase蛋白（rTgUPase）并分析其抗原性。观察不同剂量rTgUPase滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答，探讨rTgUPase免疫的适宜剂量。探讨rTgUPase作为刚地弓形虫疫苗候选抗原的可能性。　　实验方法　　第一部分：综述了不同生物来源的UPase蛋白的理化性质及研究进展。　　第二部分：对TgUPase基因编码蛋白进行生物信息的分析，预测其理化性质，二级结构以及潜在的抗原表位。　　第三部分：收集、纯化RH株刚地弓形虫速殖子，提取总RNA。根据TgUPase基因开放阅读框（GenBank:DQ385446.1）设计引物，引入EcoRI和XhoI酶切位点，RT-PCR扩增编码TgUPase的基因片段，扩增产物经双酶切后连接入原核质粒pET30a(+)中，重组质粒转化入大肠埃希菌（E.coli）DH5α，阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定；将重组质粒pET30a(+)-TgUPase转化至E.coliBL21（DE3）加入IPTG诱导表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结合考马斯亮蓝染色检测表达产物，用蛋白质印迹（Westernblotting）分析重组蛋白的抗原性。　　第四部分：40只雌性BALB/c小鼠随机分为5组，免疫组分别用10μg、20μg、30μg、40μgrTgUPase溶于总体积为20μl的PBS中，对照组用20μlPBS代替，第0、14和21d各滴鼻免疫1次。末次免疫后14d，眼静脉丛采血，分离血清。颈椎脱臼处死小鼠，分离脾淋巴细胞计数培养，分别用rTgUPase或ConA刺激脾淋巴细胞，CCK-8试剂盒测定其增殖指数。收集小肠、鼻咽、阴道和膀胱冲洗液。ELISA测定血清IgG和IgA水平，4种冲洗液sIgA水平，测定脾淋巴细胞培养上清细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ含量。　　第五部分：60只BALB/c小鼠随机分为2组，免疫组用30μgrTgUPase（溶于20μlPBS），对照组用20μlPBS，第0、14和21d各滴鼻免疫1次。末次免疫后14d，分别用1×104速殖子（慢性感染，免疫组和对照组各10只）或4×104速殖子（致死性感染，免疫组和对照组各20只）灌胃攻击小鼠。攻击后30d，颈椎脱臼处死慢性感染小鼠，分离计数肝、脑组织内速殖子。逐日观察和记录致死性感染小鼠健康状况，计算30d存活率。　　实验结果　　rTgUPase蛋白由303个氨基酸组成，分子量为33042.9，等电点理论值为6.66，为可溶性蛋白，不含有信号肽，有11个翻译后修饰位点，亚细胞定位于细胞质中，有6个潜在的T、B细胞联合抗原表位。　　RT-PCR扩增产物约为921bp，菌落PCR、双酶切以及测序结果表明重组质粒pET30a(+)-TgUPase构建成功。SDS-PAGE结果表明，经IPTG37℃诱导目的基因在E.coliBL21（DE3）中高效表达，获得相对分子量（Mr）约39kDa的可溶性重组蛋白。Westernblotting显示，诱导表达的重组蛋白质具有HIS标签，且能被兔抗弓形虫免疫血清识别。　　小鼠脾淋巴细胞增殖实验结果表明30μg组最高，但组间差异无统计学意义。30μg和40μg组血清IgG和IgA水平高于对照组（P<0.01）；免疫组（10μg、20μg、30μg、40μg组）肠冲洗液IgA水平与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）；30μg和40μg组阴道冲洗液IgA水平高于对照组（P<0.05和P<0.01）；30μg和40μg组膀胱冲洗液IgA水平高于对照组（P<0.05）；30μg组鼻咽冲洗液IgA水平显著高于对照组（P<0.05）；IL-2水平30μg、40μg组与对照组差异显著（P<0.01和P<0.05）；与对照组相比，免疫组IL-4水平均增高，差异有统计学意义（P<0.01）；20μg、30μg、40μg组IFN-γ水平均高于对照组（P<0.05，P<0.01，P<0.01）。rTgUPase滴鼻免疫可以诱导小鼠的免疫应答反应，30μg组可以更有效地诱导黏膜和系统免疫应答。　　慢性感染免疫组肝和脑组织内虫荷（30.15±6.46×105/g和9.16±0.47×105/g）均显著低于对照组（62.52±8.96×105/g和18.18±1.03×105/g）（F=62.594，P<0.01和F=450.382，P<0.01），减虫率分别为51.78％和49.61%。致死性感染免疫组30d生存率为21.1%，而PBS组小鼠在攻击后第12d全部死亡，两者的生存率曲线分布差异有统计学意义（c2=6.146，P<0.05）。　　结论　　生物信息学分析结果显示刚地弓形虫UPase基因编码的蛋白为可溶性蛋白，具有抗原性，我们成功构建重组质粒pET30a-TgUPase并在E.coli中高效表达可溶性蛋白，并通过Westernblot证实rTgUPase具有抗原性。rTgUPase滴鼻免疫能有效诱导黏膜和系统免疫应答，并有效抵抗弓形虫感染，有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。