智力障碍(Intellectual Disability,ID)在神经和精神疾病中十分常见,比如在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、自闭症(Autism spectrum disorder,ASD)中十分常见。智力障碍的病人的智商(Intellectual Disability,IQ)往往较正常人低,小孩子伴有智力障碍者在学习语言、社会交往、自理能力方面较正常孩子缓慢。而自闭症是一种以社会交往和沟通能力受损,重复的、刻板的行为学并常常伴有智力和认知功能障碍为特征的神经发育障碍性疾病。无义介导的m RNA降解(Nonsense Mediated m RNA Decay,NMD军控制RNA平衡和保证大量不必要的转录因子快速降解的一个RNA监控机制。这个机制依赖于外显子连接复合物(Exon Junction Complex,EJC)的多个核心因子:真核细胞翻译起始因子4AIII(Eukaryotic Translation Initiation Factor 4AIII,e IF4AIII)、肿瘤易感候选基因3(Barentsz,BTZ)、人类同源果蝇Mago nashi蛋白(human homolog of Drosophila mago nashi protein,MAGOH)和核糖核酸结合基序蛋白8a(RNA-binding motif protein 8A,RBM8a)及其附近的一些因子来区分在正常转录的终止密码子之前的非成熟终止密码子(Premature Stop Codons,PTCs)。最近,研究表明无义介导的m RNA降解因子与神经发育性障碍疾病比如自闭症、精神分裂症(Schizophrenia,SCZ)、智力障碍性疾病有联系。有遗传学研究揭示NMD在神经发育、神经再生、细胞增殖和分化等功能有重要的作用,然而,这些因子是如何控制大脑发育的机制尚不清楚。核糖核酸结合基序蛋白8a(RNA-binding motif protein 8A,RBM8a)是一个在m RNA剪接过程中与RNA结合的核蛋白,RBM8a调节的特异性调控细胞功能尤其在调控神经祖细胞增殖、分化和大脑发育的功能尚未被完全明确。因此,本研究拟在检测RBM8a基因在胚胎神经祖细胞增殖和分化的功能,以明确RBM8a基因在调控大脑发育的作用,为揭示RBM8a在神经发育障碍性疾病的病因学提供理论基础。实验内容包括以下两部分:第一部分:RBM8a基因在胚胎神经祖细胞增殖和分化中的作用目的检测RBM8a在胚鼠不同阶段和成年鼠之间的表达差异,在体外细胞系和胚鼠大脑中神经祖细胞中过表达或沉默RBM8a,观察细胞增殖和分化的改变,以明确RBM8a基因在胚胎神经祖细胞增殖和分化中的作用。方法将不同阶段胚鼠和成年小鼠的大脑皮层组织分离、裂解并收集蛋白,使用western blot进行检测RBM8a的表达。分离14天胚鼠大脑中的神经祖细胞,并在体外诱导其分化,观察RBM8a的变化。收集16天胚鼠大脑并进行固定、冰冻切片,检测胚鼠大脑皮层RBM8a表达。构建沉默RBM8a的sh RNA和过表达的RBM8a质粒,并在CAD细胞系中证实其沉默和过表达的效果。在体外,分别用RBM8a的sh RNA和过表达的RBM8a质粒转染CAD细胞,并使用Brd U标记。在体内,利用子宫内胚胎电转移技术,将sh RNA和过表达RBM8a转移到14天的胚鼠大脑皮层的神经祖细胞内,并用Brd U标记,以观察RBM8a调控神经祖细胞的增殖、分化和调节细胞周期进程。结果1.RBM8a在胚胎早期神经祖细胞增殖的时候,RBM8a的表达水平很高,而当胚鼠逐渐发育,神经祖细胞分化的时候,RBM8a的表达水平亦随之降低。2.在体外,当神经祖细胞分化的时候,RBM8a的水平明显降低。在16天胚鼠大脑皮质的室管膜层和室管膜下层,RBM8a与巢蛋白阳性的神经祖细胞中大量表达,而在双肾上腺皮质激素阳性的迁移神经细胞和不成熟神经元聚集的中间层和皮质外层RBM8a表达明显减少。RBM8a在CAD细胞被沉默后细胞分裂指数明显降低,细胞增殖减少,而过表达RBM8a后,CAD细胞分裂指数明显升高,促进细胞增殖。3.在动物肾RBM8a可见以神经祖细胞为主室管膜层和室管膜下层的细胞减少,而增加了进入分化的神经元所在的中间层和皮质外层;相反,过表达胚鼠大脑皮质中的RBM8a后,转移至中外层的细胞减少而在室管膜层和室管膜下层的细胞增多,表明RBM8a正性调节神经祖细胞的增殖。4.在动物肾RBM8a时,细胞周期退出指数增加32%,导致神经祖细胞的减少,而分化成新生神经元增多;相反,过表达RBM8a后,细胞周期退出指数减少30%,导致神经祖细胞的增殖并抑制神经祖细胞分化成新生的神经元。结论RBM8a基因在调节早期神经发育扮演着重要作用;RBM8a促进胚胎神经祖细胞增殖和抑制神经元的分化;RBM8a在维持神经祖细胞增殖与分化的平衡中起重要作用。第二部分:基于RNA-seq技术对RBM8a调控的基因和信号通路分析目的通过以RNA-seq技术为基础的转录组学分析,识别大脑中RBM8a可能调控的神经精神疾病相关的下游基因和信号传导通路。方法构建过表达RBM8a质粒p TRIPZ-m Cherry-RBM8a和对照质粒p TRIPZm Cherry,将它们包装慢病毒载体,构建过表达RBM8a的SH-SY5Y稳定细胞系,利用强力霉素诱导过表达RBM8a在细胞系中表达,利用TRIzol试剂提取总RNA,使用Ribo Zero试剂盒选择性的去除r RNA。使用Illumina Hi-Seq2500平台,进行高通量RNA测序,使用软件工具分析过表达RBM8a与对照组之间有显著差异性表达的转录因子。将有差异性表达的基因列表与现有的不同的神经精神疾病数据库中高危基因相互对照,识别出他们之间重叠的基因,并进一步使用western blot在CAD细胞中验证RNA-seq有差异表达的基因的蛋白表达是否一致。利用DAVID生物信息分析软件,分析RBM8a下游有差异表达的基因可能参与调控的信号传导通路。最后分析本研究中有差异表达的基因是否导致有差别的选择性剪接,是否有通过NMD调控的靶点基因。结果1.成功构建过表达RBM8a质粒,提取总RNA并取出r RNA后,利用高通量RNA测序和分析,最终过表达RBM8a组和对照组的m RNA测序,超过95%的阅读都被映射到参考基因组。2.通过分析发现,过表达RBM8a后有7.08%的转录因子相对于对照组有差异。过表达RBM8a的众多下游基因与智力障碍、阿尔茨海默病、自闭症、精神分裂症数据库中的高危基因重合。自闭症高危蛋白(NLGN1列,退行性神经疾病蛋白(ATXN1列,神经再生蛋白(REST逐,胚胎发育(TLE4军脉移蛋白(KIF1A军RBM8a过表达CAD细胞中表达与RNA测序结果一致,而沉默RBM8a的CAD细胞中表达与RNA测序结果相反。3.DAVID生物信息工具分析结果提示RBM8a调控了包括丝裂学激促酶/MAP激酶等信号传导通路、生长因子信号传导通路、Rho信号传导通路、包含整合素和胶A倾览丁传导通路中的许多重要基因。4.本研究中371个选择性剪接事件中有101蛋白编码基因有显著性差异,这些选择性剪接的基因中许多与自闭症(Autism spectrum disorder,ASD)的高危基因相重叠,与ASD的发病机制密切相关。5.在有差异表达的1788个基因中有814个基因表明与NMD有关联,它们分别与ASD、SCZ、AD和ID的高危基因重合。结论无偏倚的RNA测序分析揭示了RBM8a调控着与许多退行性神经疾病、精神疾病密切相关的高危基因和早期神经发育的重要过程。