目的：　　为研究α2肾上腺素能受体（α2adrenergicreceptor,α2AR）在急性肺损伤中调节肺微血管内皮屏障的作用，本研究通过使用炎症介质肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactorα，TNF-α)刺激人肺微血管内皮细胞(humanpulmonarymicrovascularendotheliacell，HPMEC)作为离体模型，通过使用α2AR激动剂、α2AR拮抗剂及α2AR亚型拮抗剂，观察各干预措施对TNF-α刺激后肺微血管内皮屏障各指标变化的影响以及对可以进一步损坏肺微血管内皮屏障的白细胞粘附效应的影响，明确α2AR激动剂还是与拮抗剂对TNF-α诱导的肺微血管内皮屏障功能失调具有直接保护作用，作用是否具有亚型特异性，并进一步研究其分子机制。　　方法：　　1.检测HPMECα2AR活性药物亚型特异性。通过逆转录聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR）和蛋白质免疫印迹分别在转录与蛋白表达水平确定HPMEC细胞上α2AR亚型的分布，使用相应的亚型拮抗剂来观察α2AR活性药物作用的亚型特异性。　　2.检测内皮屏障功能变化。实验分为六组：对照组（HPMECs内不添加TNF-α及药物）、TNF-α组（使用TNF-α处理HPMECs）、右美托咪定组（在向HPMECs内添加TNF-α之前预先加入右美托咪定50μM预处理一小时）、育亨宾组（在向HPMECs内添加TNF-α之前预先加入育亨宾50μM预处理5分钟）、BRL44408组（在向HPMECs内添加TNF-α之前预先加入BRL44408100μM预处理5分钟）、JP-1302组（在向HPMECs内添加TNF-α之前预先加入JP-1302预处理5分钟）。检测指标包括三个部分：⑴内皮单层通透性的变化：通过内皮细胞单层对辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）的透过率来反映；⑵细胞骨架变化：通过免疫荧光法观察纤维型肌动蛋白（filamentous-actin,F-actin）的结构变化来反映细胞骨架重构并计算IOF（intensityoffluorescence）值；⑶细胞间连接变化：采用蛋白质免疫印迹(westernblot)法检测内皮细胞间的主要粘附连接蛋白：血管内皮钙粘蛋白（vascularendothelialcadherin,VE-cadherin）的表达。　　3.检测HPMEC的白细胞粘附指标。实验分组同上，检测指标包括：⑴细胞间粘附因子（intercellularadhersionmolecule-1,ICAM-1）的表达：通过westernblot和酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）检测内皮细胞膜ICAM-1的表达；⑵体外白细胞粘附率；使用人原髓细胞白血病细胞（HL-60cells）与HPMEC细胞共孵育，观察上述各组的白细胞粘附率。　　4.细胞凋亡检测。实验分组同上，通过FITC荧光标记的膜联蛋白V/碘化丙锭（AnnexinV-FITC/PI）染色HPMEC细胞,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡的变化。5.细胞内信号机制的检测：⑴通过westernblot检测与免疫荧光方法观察TNF-α作用下和预先应用右美托咪定时HPMEC内RhoA激活水平(activeRhoA/总RhoA)和NF-κB信号通路激活状态（NF-κBp65核转位与细胞质IκBα水平）的变化；⑵通过观察使用LPA(RhoA激活剂)后NF-κB信号通路的激活状态的变化和在TNF-α前预先使用PDTC(NF-κB信号通路抑制剂)对RhoA激活的影响，检测RhoA和NF-κB信号通路的相互影响。⑶观察使用LPA和预先使用PDTC来观察调节RhoA/NF-κB信号通路对HPMEC单层通透性的影响和细胞膜ICAM-1表达的影响。　　结果：　　1.RT-PCR与westernblot结果均提示在人肺微血管内皮细胞，仅有A亚型和C亚型转录与表达，未检测到B亚型；　　2.α2AR激动剂右美托咪定可以使TNF-α诱导的人肺微血管内皮通透性增高幅度降低，右美托咪定组与TNF-α组相比较，各时间点(4h、8h、12h、24h)HRP通透率分别为：10.43±0.53%vs13.65±0.56%(P=0.000,n=3)，16.51±0.36%vs30.78±1.12%(P=0.000,n=3)，16.42±1.38%vs40.69±1.91%(P=0.000,n=3)，29.27±0.68%vs40.69±1.91%(P=0.000,n=3)，差异显著。右美托咪定稳定F-actin的结构，右美托咪定组与TNF-α组相比较，F-actin的IOF值分别为：18.87±0.48vs8.39±0.32(P=0.000,n=3)。右美托咪定还可以抑制TNF-α诱导的VE-cadherin表达水平减低，右美托咪定组与TNF-α组的相对值分别为：0.915±0.055vs0.62±0.045(P=0.000,n=3)。上述三种效应的趋势相同。　　3.右美托咪定能使TNF-α刺激下细胞表面增高的ICAM-1表达水平降低，右美托咪定组与TNF-α组相比较OD值分别为：0.32±0.03vs0.68±0.05(P=0.000,n=3)。相对应地，右美托咪定使TNF-α刺激状态下的升高的白细胞粘附率降低，右美托咪定组与TNF-α组相比较为：39.20±2.15%vs49.97±4.21%(P=0.002,n=3)。　　4.右美托咪定对TNF-α诱导的HPMEC细胞凋亡无改善作用，右美托咪定组与TNF-α组相比较凋亡率分别为：9.05±1.73%vs9.81±1.28%(P=0.560,n=3)。　　5.α2AR拮抗剂育亨宾和亚型特异性拮抗剂BRL44408和JP-1302在保护肺微血管内皮屏障与白细胞粘附方面均表现出与右美托咪定相反的作用，且育亨宾的作用最强。6.TNF-α可以诱导RhoA的激活和NF-κB通路的激活，与对照组相比activeRhoA/总RhoA比值为：0.92±0.09vs0.66±0.06(P=0.007,n=3)；IκBα的水平：0.52±0.03vs1(P=0.000,n=3)。这些激活作用可以被预先应用右美托咪定所抑制，右美托咪定组与TNF-α组activeRhoA/总RhoA比值分别为：0.52±0.06vs0.92±0.09(P=0.000,n=3)；IκBα的水平：1.14±0.13vs0.52±0.03(P=0.000,n=3)。预先应用PDTC也可以抑制TNF-α诱导的RhoA激活，该组与TNF-α组相比activeRhoA/总RhoA比值分别为：0.62±0.05vs0.92±0.09(P=0.001,n=3)。LPA可以诱导NF-κB通路的激活，LPA组与对照组的IκBα水平分别为：0.62±0.04vs1(P=0.000,n=3)，在作用趋势与TNF-α相同。LPA可以增加内皮细胞单层通透性，LPA组与对照组相比HRP通透率分别为：25.55±3.54%vs10.02±0.93%(P=0.000,n=3)，而在用LPA之前预先使用PDTC可以抑制上述趋势，该组与LPA组相比通透率分别为：18.26±2.44%vs25.55±3.54%(P=0.000,n=3)。应用LPA也可以使HPMEC细胞膜表达ICAM-1增高，并被预先使用的PDTC所抑制。LPA组与对照组相比较ICAM-1的OD值分别为：1.20±0.08vs0.27±0.06(P=0.000,n=3)，PDTC+LPA组与LPA组相比为：0.72±0.09vs1.20±0.08(P=0.000,n=3)。　　结论：　　α2AR激动剂而不是拮抗剂可以保护肺微血管内皮屏障免受TNF-α诱导的肺微血管内皮屏障损伤，其保护作用不具有亚型特异性，不是通过抗凋亡作用实现的，RhoA/NF-κB通路参与了α2受体激活对肺微血管屏障功能的保护作用。　　意义：　　急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）是死亡率较高的临床综合征，其根本原因是肺部炎症级联放大失去控制。肺微血管内皮细胞通透性的增加导致肺水肿，使得血气屏障的厚度增加，导致弥散效率降低，是ARDS的重要病理生理基础之一。研究在炎症介质作用下肺微血管内皮屏障功能的改变，对于阐明ARDS病理生理机制，探寻ARDS新的治疗靶点具有重要意义。　　本研究首次在人肺微血管内皮细胞层面从正反两方面验证了α2AR受体激动剂对肺微血管屏障的保护作用，且探索了α2AR激动肺保护作用的细胞学与分子生物学机制。研究结果提示α2AR在抗炎症反应性肺损伤方面将成为重要的靶点，是值得继续深入研究的方向。