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魔芋软腐病是湖北省魔芋生产上发生最为严重的细菌性病害,一旦发生就难以控制;该病害往往导致地下块茎产量严重减少,甚至绝收,从而造成严重的经济损失。本文通过病原分离、致病性测定、形态学观察、生理生化鉴定和分子生物学分析等方法,明确湖北省魔芋软腐病的病原菌种类,并采用比较基因组学方法建立魔芋软腐病菌的环介导等温扩增(LAMP)快速检测技术,以及基于活性荧光染料溴化乙锭(EMA)、实时荧光定量PCR结合的活体快速检测技术,为魔芋软腐病的早期诊断与病害防控提供重要依据。主要研究结果如下:(1)从湖北省宜昌市点军区、长阳县、枝江市、五峰县等魔芋种植区采集软腐病病株,共分离得到110株细菌;通过科赫式法则验证,其中45株分离菌株为魔芋软腐病致病菌;通过形态观察、生理生化测定以及分子生物学鉴定(特异性PCR扩增、16S rDNA序列分析和多基因联合系统发育分析),将魔芋软腐病病原鉴定为两种,一种为Pectobacterium aroidearum,共分离得到30株,占全部病原菌的66.7%,另一种是Dickeya fangzhongdai,共分离得到15株,占全部病原菌的33.3%,其中P.aroidearum是湖北省魔芋软腐病的主要病原菌。(2)通过基因组比对的方法建立魔芋软腐病菌P.aroidearum的环介导等温扩增(LAMP)快速检测技术。将P.aroidearum菌株PC1的4393个基因序列用TBLASTX与50-基因组核酸数据库进行第一轮比对,得到132个基因在50-基因组核酸数据库中无匹配,再将这132个基因序列与GenBank NR数据库进行第二轮比对,得到P.aroidearum的30个特异性基因。挑选9个P.aroidearum基因设计LAMP特异性引物,通过筛选确定引物组1675-1为LAMP检测最佳引物,LAMP检测具有较高的特异性和灵敏度。LAMP引物组1675-1对24个P.aroidearum菌株的LAMP扩增产物可以明显观察到白色沉淀的产生,且加入SYBR Green I均呈现绿色荧光,属于阳性反应;而其它菌株的LAMP扩增均为阴性反应。在65℃恒温条件下进行LAMP检测,40 min内可检测到50 fg/μL的P.aroidearum基因组DNA,比常规PCR灵敏度高100倍。LAMP引物组1675-1在检测人工接种P.aroidearum的土壤样品时,可在土壤中检测到低至1.2×10~4CFU/g浓度的魔芋软腐病菌P.aroidearum,比常规PCR检测灵敏度高10倍。此外,LAMP引物组1675-1可应用于田间魔芋组织、土壤样品的检测,能够检测到处于潜伏侵染的P.aroidearum,且田间发病率与魔芋组织和土壤检测带菌率存在一定正相关。因此,LAMP对处于潜伏侵染的病原菌检测为病害的早期预防和及时防控提供了重要依据。(3)将活性荧光染料EMA与实时荧光定量PCR结合建立魔芋软腐病菌P.aroidearum的活体检测技术。首先采用引物1675-1F3/1675-1B3建立P.aroidearum的Real-time PCR检测体系,能够检测低至300 fg/μL的P.aroidearum基因组DNA,Real-time PCR扩增Ct值与基因组DNA浓度对数值之间具有良好的线性关系,由此建立标准曲线y=-3.4725x+41.184(R~2=0.9995)。同时,优化EMA反应终浓度,使其能够完全抑制P.aroidearum死细胞DNA扩增,且对活细胞DNA扩增完全没有影响,最终确定EMA最佳终浓度为8μg/mL;对EMA曝光时间进行优化,确定最佳曝光时间为3 min。当用EMA-qPCR检测魔芋软腐病菌P.aroidearum死、活菌混合液时,EMA-qPCR能对活菌DNA进行选择性扩增,且无假阳性出现,而传统qPCR不能有效区分死、活细胞。此外,EMA-qPCR可应用于田间魔芋组织样品中P.aroidearum的检测,且能定量活体菌。