论文部分内容阅读
背景:胚胎干(Embryonic stem,ES)细胞定向分化心肌细胞模型是一高仿真胚胎心肌发育的体外研究替代系统。线粒体依赖性能量通路是启动ES细胞向心肌细胞分化的关键环节,线粒体缝隙连接蛋白43(Mitochondrial Cx43,mtCx43)与线粒体功能和能量代谢密切相关。本课题组前期研究发现,S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)短暂处理可促进ES细胞定向分化为心肌细胞,同时发现GSNO处理后有104个蛋白分子S-亚硝基化上调。根据细胞定位对这些蛋白进行分类,80%蛋白定位于细胞器中,特别是核糖体和线粒体。然而mtCx43是否经由S-亚硝基化修饰参与调控GSNO诱导ES细胞定向心肌分化尚不明确。目的:本研究拟从mtCx43的S-亚硝基化修饰对线粒体功能影响的角度,揭示mtCx43的S-亚硝基化修饰在GSNO诱导ES细胞体外定向分化为心肌细胞中的作用。方法及结果:1.GSNO经调控mtCx43的S-亚硝基化诱导小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞利用小鼠ES细胞体外心肌分化的模型,在day 5给予25?mol/L GSNO短暂处理拟胚体(Embryonic bodies,EBs)2 h,发现GSNO处理组EBs的搏动率显著高于对照组,且心肌特异性蛋白α-actinin表达显著上调。免疫荧光结果也显示GSNO诱导后更易形成明暗相间的肌小节成熟结构。在day 5和day 5+3分别检测Cx43及mtCx43的表达,Western Blot结果显示Cx43及mtCx43的表达呈发育依赖性增加,而GSNO的处理并不影响其表达。随后联用Biotin-Switch与SDS-PAGE技术检测GSNO给药2 h后Cx43及mtCx43的S-亚硝基化修饰,结果显示GSNO处理显著增加Cx43及mtCx43的S-亚硝基化修饰水平。进一步为验证mtCx43的S-亚硝基化修饰与GSNO促进小鼠ES细胞定向心肌分化的相关性,我们采用慢病毒转染技术过表达mtCx43及其S-亚硝基化位点(C271)突变体mtCx43C271A。结果显示,与GSNO处理组相比,mtCx43+GSNO处理组mtCx43的S-亚硝基化修饰水平显著上调,而mtCx43C271A+GSNO处理组没有明显变化。相应地,与mtCx43C271A+GSNO处理组相比,在day 5+3,mtCx43+GSNO处理组EBs的搏动率显著增加,且α-actinin表达明显上调。免疫荧光结果也显示mtCx43+GSNO诱导后更易形成明暗相间的肌小节成熟结构,提示GSNO经mtCx43的S-亚硝基化修饰途径诱导小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞。2.mtCx43的S-亚硝基化修饰促进mtCx43半通道开放参与GSNO诱导小鼠ES细胞心肌分化中对线粒体的调控作用利用Western Blot技术检测day 5 GSNO给药2 h后线粒体动力相关蛋白(Dynamin-related protein 1,Drp1)、线粒体融合蛋白1/2(Mitofusion1/2,Mfn1/2)的表达,结果显示GSNO处理增加了线粒体Drp1及Mfn2的表达。当过表达mtCx43后,进一步增加Mfn2的表达,但不影响线粒体Drp1的表达;而过表达mtCx43C271A后,与GSNO处理组相比,Mfn2及线粒体Drp1的表达均无明显变化。在线粒体相关功能检测实验中发现,GSNO处理EBs 2 h显著促进线粒体的成熟及增强线粒体的功能,包括膜电位上升、ATP产量增加、mtCx43半通道通透性增加、线粒体ROS浓度升高以及线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性增强;当过表达mtCx43后进一步促进GSNO对线粒体的调控作用,而过表达mtCx43C271A没有该促进作用。上述结果均提示GSNO可通过mtCx43的S-亚硝基化修饰促进心肌分化过程中线粒体融合并调控线粒体能量代谢相关功能。为了进一步验证mtCx43的S-亚硝基化修饰是否通过促进mtCx43半通道开放来调控线粒体功能,进而在GSNO促进小鼠ES细胞定向心肌分化中发挥作用,我们利用mtCx43半通道特异性阻断剂Gap19在GSNO给药前0.5 h进行预处理EBs,随后检测Drp1及Mfn2的表达、线粒体相关功能以及ES细胞定向心肌细胞分化率。结果显示,Gap19显著降低Mfn2表达而不影响Drp1表达,抑制线粒体的成熟及线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性,ROS及ATP产量减少;且Gap19与GSNO合用则拮抗GSNO对Mfn2表达和线粒体功能的促进作用。同时Gap19显著降低day 5+3 EBs搏动率,α-actinin表达以及肌小节结构形成,且Gap19可以拮抗GSNO促心肌分化作用。上述结果提示GSNO致mtCx43的S-亚硝基化修饰可通过促进mtCx43半通道开放实现对EBs线粒体的调控作用,从而诱导小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞。结论:1.GSNO经由mtCx43的C271位点发生S亚硝基化修饰,促进小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞。2.mtCx43的S-亚硝基化有利于mtCx43半通道开放,增加GSNO诱导心肌分化早期EBs中Mfn2表达,促进线粒体成熟及complexⅠ活性,提高ATP及ROS产量。