胃肠激素受体及受体后信号转导与调控是在分子水平对复杂机体中单个细胞内及细胞间相互交流信号的研究,是当今生命科学研究的前沿课题。业已证实,脾虚证与胃泌素关系密切,脾虚大鼠胃粘膜及壁细胞胃泌素受体结合容量显著降低,不少调理脾胃方药对胃泌素及胃泌素受体有显著的调节作用,脾虚证很可能是胃泌素受体相关性疾病。本次实验研究应用放射配基结合法与跨膜信息转导机理研究新技术,系统研究脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体表达方式与磷酯酰肌醇通路信号转导规律变化以及益气健脾方药党参、白术、补中益气汤的调控作用,对于探讨脾虚证与胃泌素受体的关系,阐明脾虚证病理机转规律及健脾方药药理作用均有重要意义。 1大鼠胃壁细胞的分离纯化 细胞分离的方法通常有两种:机械分离法和酶分离法。不同种属的动物及不同类型的蛋白水解酶对细胞分离效果影响迥异,胶原酶能够成功分离狗、豚鼠、兔胃的黏膜细胞,而链酶蛋白酶(Pronase)对分离大鼠胃黏膜细胞很有效,这种酶具有广泛的消化作用,与EDTA联合使用作用更加突出。本次实验采用Pronase-EDTA酶消化法分离大鼠胃壁细胞。脱颈椎处死大鼠,取胃制作翻转胃袋并注入消化酶溶液。经过消化90分钟——分散50分钟——离心收集来完成大鼠胃粘膜细胞的分离过程。大鼠胃壁细胞的纯化采用40%和60%percoll非连续密度梯度离心法。结果:即时分离的胃粘膜细胞活度经台盼兰排除实验鉴定可达到90%以上,HE染色鉴别壁细胞纯度达到70%,在0～4℃环境下22h后细胞活度仍可达70%～80%左右。大鼠壁细胞分离及纯化方法步骤明确,操作熟练,在本实验室条件下可达到较稳定的结果。 2补脾方药对脾虚大鼠壁细胞超微结构的影响