钠通道在神经元兴奋性的调控和动作电位的产生等方面起着重要的作用。钠通道病是由于编码钠通道的基因发生突变、表达异常,或内环境中出现对钠通道具有致病性物质时,钠通道的结构或者功能发生不同程度的异常,从而导致机体生理性功能紊乱,所引起的先天或后天性疾病。动物毒素多肽是钠通道的天然分子工具之一。蝎毒素是一类由28-76个氨基酸残基构成的分子多肽。通常,类α长链蝎毒素多肽作用于钠通道,延缓钠通道失活,起致痛效应,而类β长链蝎毒素多肽则相反。但由于纯天然蝎毒素蛋白获得比较困难、成本高昂,致使对钠离子通道的研究受到极大限制。因此,蝎毒素多肽基因重组表达和改造是钠通道结构与功能研究的有效途径之一。本文通过在东亚钳蝎中克隆两种兴奋性昆虫毒素BmK IT和BmK IT-AP,其中BmK IT毒素成熟肽由69个氨基酸残基组成,包含4对二硫键,主要作用于昆虫细胞膜钠离子通道,能够引起动作电位的重复发放,增强峰钠电流,延缓峰钠传导的关闭,使昆虫兴奋性麻痹死亡。BmK IT-AP毒素成熟肽由72个氨基酸残基组成,包含4对二硫键,属于一类兴奋性昆虫选择性毒素。本实验通过将末端带有六个组氨酸的基因序列克隆到载体pET-32(a)中,成功构建重组质粒pET-32(a)-N-Tag(His)-BmK IT和pET-32(a)-N-Tag(His)-BmK IT-AP。再将这两个重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中进行原核可溶性表达,并通过优化诱导表达时间、IPTG浓度、诱导表达温度得到最佳表达条件;通过对缓冲液配比和流速的优化获得大量重组毒素BmK IT和BmK IT-AP。通过全细胞膜片钳检测对其生理化学性质进行深入研究,主要获得以下结果:根据Genbank中蝎毒素多肽BmK IT和BmK IT-AP成熟肽序列设计并优化密码子,按照大肠杆菌对密码子的偏好性合成BmK IT和BmK IT-AP的基因序列,构建表达载体pET-32(a)-N-Tag(His)-BmK IT和pET-32(a)-N-Tag(His)-BmK IT-AP。重组蛋白BmK IT的理论分子量为28553.333 Da,重组蛋白BmK IT-AP的理论分子量为28113.3333 Da。通过优化诱导条件,得出蝎神经毒素BmK IT最佳表达条件为:诱导表达时间为8 h,诱导物IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导温度20℃的条件下,目的蛋白表达量占总蛋白的43.5%;蝎神经毒素BmK IT-AP最佳表达条件为:诱导表达时间5 h,诱导物IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导温度为25℃的条件下,目的蛋白表达量占总蛋白量的44.1%。采用金属镍离子亲和层析法从离心后的菌体上清液中初步分离纯化出重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT和Tag(His)-BmK IT-AP;上样前测重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT菌体上清液浓度为30μg/ml,将10 ml的菌体上清液经过镍离子亲和层析,对洗脱峰进行冷冻干燥处理,得到10μg重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT,得率约为33.3%;上样前测重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT-AP菌体上清液浓度为35μg/ml,将10 ml的菌体上清液经过镍离子亲和层析,对洗脱峰进行冷冻干燥处理得到12μg重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT-AP,得率约为34.3%;再将镍离子亲和层析中的洗脱峰进行RT-HPLC纯化,得到电泳纯级的重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT和Tag(His)-BmK IT-AP。采用全细胞膜片钳实验检测表明,将10μmol/L的重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT作用于大鼠背根节神经元细胞,与对照组相比,其激活时间稍有延缓,峰钠电流值有微小增加,而10μmol/L的重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT-AP作用于大鼠背根神经节神经元细胞,给药组较对照组峰钠电流值明显减小,同时激活时间明显延长,综上,Tag(His)-BmK IT对SD鼠的DRG细胞膜钠电流无明显调节抑制,Tag(His)-BmK IT-AP对SD鼠的DRG细胞膜钠电流具有调制抑制活性。