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1、背景和目的:胃癌是全球范围内的第四大恶性肿瘤,第二大致死性疾病,东亚地区的病例占总体的一半以上。从胃癌的组织学分类来说主要有腺癌、腺鳞癌、鳞癌、类癌等,其中绝大部分是胃腺癌。尽管现在可以通过体格检查、影像学及内镜下组织活检等检查发现胃癌,但是中国胃癌患者发现时大都临床分期较晚,进展期胃癌比例约占70%,严重影响预后。因此探究胃恶性肿瘤的相关的致病机制的研究具有重要的意义。表观遗传学是DNA碱基序列没有改变的情况下,其表型出现可传递到下一代变化的一门学科。DNA甲基化是其经典调控之一,在各种疾病的调控中起到了重要的作用。近年来,5hmC作为胞嘧啶修饰过程的中间产物,丰富了我们对DNA甲基化的表观遗传调控过程的认识,也为我们寻找胃癌相关基因提供新的线索。但目前对于全基因组5hmC在胃癌中的研究甚少。在本研究中,我们将通过hMe-Seal化学标记结合高通量测序,研究5hmC在胃癌中的表达,探讨特异性5hmC分布及作用位点与胃癌的关系。2、方法1、收集吉林大学第二医院胃肠外科2017年1月至2018年1月病理确诊为胃癌患者的手术切除标本6例,每组标本包括肿瘤组织、癌旁组织和远端正常组织。2、使用苯酚-氯仿法对DNA提取,随后利用dot blot方法对5hmC进行定量。3、利用5hmC-特异性化学印记(hME-seal)对5hmC进行标记后进行富集纯化。4、对所获得的5hmC进行文库构建、高通量测序,进行定量及定性分析,寻找差异性羟甲基(DhMRs)。5、将DhMRs定位于人基因hg19后进行生物信息学分析,后将t-p-n作为肿瘤进展阶段进行肿瘤演化分析,并探究DhMRs与胃癌超级增强子之间关系。3、结果1、通过dot blot方法确定在胃癌组织与正常胃组织相比,5hmC呈显著性下降(P<0.001),胃癌中5hmC含量平均大约只有正常组织的35%,而在正常胃组织与胃癌旁组织比较中,显示两者无明显变化(P>0.001)。2、使用化学标记法富集后高通量测序的方法(hME-seal-seq法)结果显示在肿瘤组织与正常组织相比,5hmC表达水平呈下降的趋势;在癌旁组织与正常组织中,5hmC表达水平有上升趋势。从以上结果中,我们认为5hmC表达水平在胃癌中下降,5hmC表达水平下降可以成为胃癌的特异性标志物。3、通过对差异羟甲基化CPG位点进行规范化读取计数、估计离散度和执行差异测试,将P<0.01的位点确定为DhMRs区域。结果显示有17,318的基因位点显示5hmC下降,而1344个基因位点显示5hmC上升,在癌旁组织与正常组织比较中,共有4795个基因位点上升以及1876个基因位点下降。并发现DhMRs区域在基因组中主要分布于基因内部,而在基因间区减少。4、将DhMRs映射到hg 19人类参考序列寻找相应基因,并进一步对这些基因进行GO通路分析发现DhMRs参与多个肿瘤途径,而且在肿瘤组织与癌旁组织内有明显的差异。我们推测周围组织和肿瘤组织相关的独特的5hmC的DhMRs改变,可能反映了肿瘤发生的不同阶段。我们使用模体分析对于所检测的DhMRs进行潜在转录因子的结合位点的分析。结果显示缺氧诱导因子1(HIF1)在肿瘤组织及癌旁组织中的DhMRs共同基序相结合。此外,Myc结合位点在肿瘤组织DhMRs中增多。这些结果提示,在胃癌发生发展中5hmC的改变可能导致HIF1和Myc与DNA的结合出现变化。5、将t-p-n进行肿瘤演化分析,我们的结果显示出了一组不同的DhMRs,在出现5hmC表达上升的共有74个基因位点而5hmC含量下降的共有3481个基因位点,而进行DhMRs分布趋势分析中,发现DhMRs在基因内富集如翻译区、启动子及外显子,而在基因间区内较为少见,与之前结果相似。但在GO通路分析时,DhMRs的功能与前两组DhMRs有所不同,特别是在5hmC下降的DhMRs位点中,主要与参与剪接和核苷调节以及GTPase介导调节的信号转导等通路有关。而在5hmC表达上升的的DhMRs位点中,主要以Ras相关信号通路与剪接变体等有关6、DhMRs中与已鉴定的胃癌超增强子有显著重合,5hmC与胃癌密切相关。4、结论综上所述,胃恶性肿瘤发生发展过程中,表观遗传学的改变起到了重要作用。我们的结果显示5hmC表达含量降低与胃肿瘤密切相关,在胃癌中具有特异性。在特异性羟基甲化区域中,我们发现差异位点多位于肿瘤基因内部,5hmC可能参与肿瘤发生。通过分析DhMRs与相关信号通路,DhMRs(5hmC的损失和5hmC的增加)在涉及许多选择性途径的基因中富集。在模体分析中,我们发现在胃癌发生发展中5hmC的改变可能导致HIF1和Myc与DNA的结合出现变化。在肿瘤进展分析中,我们发现了 5hmC含量下降与胃肿瘤进展更为显着相关,且推测5hmC的改变可能导致诸多通路改变诸如RAS基因失调并导致胃癌进展。此外,我们观察到DhMRs与先前确定的超级增强剂之间存在明显的重叠。这些数据共同表明5hmC的改变可能潜在地促进胃癌的发生和发展。研究胃癌与5hmC可为早期诊断、治疗及预后评估等提供重要的指导意义。