植酸存在下鸡蛋白蛋白干燥加热磷酸化的研究

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蛋白质磷酸化已经成为一种改善食品蛋白功能特性的有效方法。本课题组在前期研究中,采用磷酸盐通过干燥加热方法修饰蛋清蛋白(EWP),功能表征发现该磷酸化EWP的热稳定性、乳化性和凝胶能力等功能特性得到明显改善,表明在磷酸盐存在的情况下,通过干燥加热方法修饰食品蛋白以提高其功能特性是一种有效的方法。植酸(Phytic Acid,PA)是一种有机磷酸类化合物,存在于谷物等可食用植物中,具有绿色安全的特点,广泛用作食品添加剂。然而,目前利用植酸进行共价修饰食品蛋白的案例还未见报道。因此本文首次采用植酸通过干燥加热方法制备植酸修饰的蛋清蛋白(PA-EWP),并详细研究了PA-EWP的理化特性、功能特性及其结构变化。首先,本文研究了干燥加热制备PA-EWP中各种条件对蛋白质磷酸化的影响,确定最优制备工艺为p H 4.0、90℃下干燥加热3 d。理化特性分析发现PA-EWP的有机磷含量为2.01%、溶解性为92.72%、表面巯基含量为0.14mol/mol且表面疏水性明显增强,另外,PA-EWP中磷酸基对酸稳定对碱不稳定,表明它与氨基酸的羟基成功形成了磷酸酯。上述结果表明采用植酸通过干燥加热方法成功修饰了EWP,并且还改变了其理化特性。其次研究PA-EWP功能特性。功能表征发现,相较于未修饰EWP,植酸磷酸化获得的PA-EWP在热稳定性、被消化性、乳化性、乳化稳定性以及抗氧化活性等功能特性方面都得到了显著的改善。为了加深理解PA-EWP功能特性得到改善的原因,随后从结构角度出发,研究了植酸磷酸化前后EWP的结构变化。电泳检测发现PA-EWP迁移速率随着磷酸化水平的提高而增加,表明在植酸的存在下,通过干热促进了EWP的热诱导聚合;31P NMR数据也证明了植酸的多磷酸基团与EWP有效结合。由于卵清蛋白(OVA)是EWP的主要成分,其结构变化能显著影响EWP的功能特性,因此,进一步分析了PA-OVA结构。CD数据表明,PA-OVA的二级结构较OVA变化不大;荧光强度和差示扫描量热结果显示,PA-OVA的Trp荧光强度明显降低;且变性温度从77.7℃降低到75.2℃,证明PA-OVA三维构象发生改变。因此,在植酸的存在下通过干热形成一种新型OVA“融熔”球状结构。大豆苷元(Dai)作为功能性食品成分之一,水溶性差,易结晶,严重限制了其应用。由于PA-OVA具有优良的功能特性,本文还尝试采用PA-OVA改善Dai的结晶沉淀以促进其利用。与N-OVA、DH-OVA相比,发现PA-OVA能较好抑制Dai的结晶,且溶液可稳定放置一个月而不结晶。测试发现PA-OVA-Dai上清液中Dai含量较高,且PA-OVA-Dai溶液透光率为92%。通过XRD、TEM和偏光显微镜表征表明PA-OVA有效阻止了Dai结晶沉淀的产生。通过光谱手段证明了Dai对PA-OVA的猝灭作用,并发现静态和动态猝灭同时存在。进一步分析发现,在Dai存在的情况下,植酸磷酸化显著提高了与Dai的结合亲和力,Ka=1.14×106,比天然OVA(Ka=6.57×105)高约1.7倍。通过计算热力学常数可得,Dai与PA-OVA主要驱动力为疏水力,分子对接进一步验证Dai与OVA主要通过疏水相互作用而结合。CD谱图表明,Dai的加入对PA-OVA的二级结构没有影响。以上结果表明PA-OVA可用作大豆苷元结晶抑制剂。因此,首次使用天然有机磷化合物植酸作为修饰基团,通过干燥加热方法对EWP进行磷酸化改性,使得EWP的功能特性得到显著提高,这为EWP的改性提供了一条新的、绿色安全的思路,也提出了一种新的提高EWP功能特性的方法。此外,还利用PA-OVA有效抑制Dai结晶沉淀,并探索了PA-OVA与Dai的相互作用机制,这些发现为PA-OVA的应用提供了新思路。
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