论文部分内容阅读
一、研究目的本课题从体外实验研究PI3K/Akt抑制剂(LY294002)对鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性的影响并探讨其可能机制,为探讨鼻咽癌放射增敏靶点提供实验依据。二、实验方法1.体外培养人鼻咽癌细胞CNE-1,本实验分为四组:对照组(A)、单纯放射组(B)、单纯药物组(C)、加药联合放射组(D),按细胞逐步稀释,采用的逐渐增加的放射剂量,分别为0 Gy、2 Gy、4 Cy、6 Gy、8 Gy、10 Gy,PI3K/Akt抑制剂(LY294002)的试验浓度为20μmol/L,利用细胞克隆形成实验观察各组CNE-1细胞存活情况,单击多靶数学模型以及L-Q模型拟合剂量存活曲线。2.采用流式细胞仪技术分析四组细胞周期分布和细胞凋亡率,其中照射组予单独单次总剂量2Gy。3.RT-PCR检测Bad、Ku70、Ku80mRNA的表达;western blot方法检测磷酸化Akt(pAkt)和凋亡相关蛋白Bad蛋白的表达。4.数据分析以及统计结论:实验的数据结果均值用x+s表示,两组比较用t检验,组间比较采用单因素方差分析,相关性采用pearson直线相关分析,p<0.05认为有统计学显著差异。本试验统计工具采用SPSSl6.0统计软件行数据分析,以及SigmaPlot11.0辅助分析以及制图。三、实验结果1.LY294002联合照射组Do、Dq、SF2明显比单纯放射组低。CNE-1细胞集落形成实验结果显示:鼻咽癌细胞受不同剂量照射后,B组和D与A组相比,细胞集落形成能力受抑制,放射剂量的增加,集落形成能力受抑制更明显;在相同的放射剂量时,D组细胞集落形成率明显低于B组;根据数据结果在电脑拟合的细胞存活曲线,其结果显示:D组Do值为0.522 Gy,Dq值为2.54Gy;B组Do值为0.783 Gy,Dq值为2.16 Gy,SER为1.36;a/β值B组(1.78Gy)小于D组(9.65Gy);LY294002联合照射可以提高放射敏感性。2.流式细胞仪结果: PI3K/Akt抑制剂(LY294002)与CNE-1细胞作用后,出现明显的G2/M期阻滞,导致G2/M期细胞比例增加。四组的G2/M期细胞比例分别为:20.04%、29.12%、35.37%、48.13%,其中D组G2/M期比例最高,与各组相比有统计差异(p<0.05)。凋亡率检测结果表明各处理组凋亡指数均增高,B组C组和D组分别是A组的3.54、4.63、6.33倍(p<0.05),D组凋亡指数最高;G2/M期细胞与凋亡指数相关分析结果显示二者间存在正相关关系(rs=0.863,p<0.05)。3. RT-PCR结果显示放射以及抑制剂LY294002均可提高Bad mRNA的表达,而药物联合放射组中Bad mRNA的表达显著增高,(p<0.05);放射后Ku70mRNA的表达增高,而抑制剂LY294002单纯作用CNE-1细胞后Ku70mRNA的表达水平无改变,但联合放疗后,可以降低放射后的Ku70mRNA的表达水平,(p<0.05);本实验中Ku80 mRNA的表达水平在各实验组中未观察到明显改变。4. western blot结果: LY294002联合放射组Bad蛋白表达增高,与PCR结果一致;放射后pAkt的表达无明显变化,LY294002作用CNE-1细胞后pAkt蛋白表达减低,证实LY294002可抑制细胞内pAkt,抑制剂联合放射后,pAkt受抑制更加明显(p<0.05)。四、结论1.LY294002对体外鼻咽癌细胞CNE-1具有放射增敏作用;2.LY294002对体外鼻咽癌细胞CNE-1放射增敏的作用主要通过降低pAKT水平,抑制P13K/Akt传导路径功能实现;3.LY294002对体外鼻咽癌细胞CNE-1放射增敏的效应,与下面三个方面有关:①改变周期细胞分布,G2/M期细胞比例增加;②抑制Ku70,减少CNE-1细胞DNA损伤后的再修复;③提高促凋亡因子Bad的表达,促进细胞的凋亡。