目的：　　 人巨细胞病毒(Human Cyto megalo virus,HCMV)感染在人群中普遍存在,可引起新生儿多种畸形和疾病,也可引起免疫低下患者的致死性感染,其危害巨大。有学者推测HCMVUL/b’区可能在病毒的复制、潜伏和对宿主的致病性方面起重要作用,因而UL/b’区基因及编码蛋白在HCMV感染和致病性方面受到特殊关注。位于UL/b’区内的UL136基因具有相应的mRNA结构,其编码蛋白分子量约为27.3KD的碱性蛋白,目前其编码蛋白的功能仍不清楚。本文从酵母双杂交筛选、Pull-down、激光共聚焦技术三个方面对HCMVUL136编码蛋白相互作用蛋白进行了筛选和功能研究。　　 实验材料与方法：　　 一、实验材料　　 标本来自中国医科大学附属盛京医院病毒室保存的临床低传代HCMV分离株H株(传代次数<5次)。MatchmakerGALTwo-HybridSystem购自Clontech公司(Japan)。人胎脑cDNA文库由武汉大学生命科学院肖庚富教授惠赠。DNAPurificationSystem、MagneGSTTMPull-downSystem试剂盒购于Promega公司(USA)。引物合成及测序由Invitrogen公司(Shanghai,China)完成。常用数据库及分析软件如基因组数据库、蛋白质分析数据库、引物设计软件等。　　 二、实验方法　　 (一)酵母双杂交筛选　　 1、以HCMVH株的DNA为模板,利用PCR扩增获得UL136基因片段,将EcoR1和BamH1酶切后的UL136基因片段连接至同时酶切的pGBKT7载体上,构建pGBKT7-UL036重组质粒,PCR鉴定,并测序分析验证。　　 2、将pGBKT7-UL136重组质粒与人胎脑cDNA文库质粒共同转化至酵母菌株AH109中,涂布于二缺(SD/-Leu/-Trp)及四缺(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)平板上,30℃培养至菌落长出,以X-gal筛选蓝色的阳性克隆。　　 3、提取酵母阳性质粒。电穿孔转化到大肠杆菌TG1中,在含氨苄青霉素的培养基中筛选出含cDNA文库的阳性克隆。进行回转验证,观察其在四缺培养基上的生长状况。　　 4、鉴定后的阳性克隆进行测序,经Genbank生物信息学软件进行BLAST分析。最终筛选出的文库质粒为pACT2-ATP1B1。　　 (二)Pull-down技术鉴定　　 1、利用EcoR1和Xho1两种限制性内切酶,酶切文库质粒pACT2-ATP1B1,克隆到同时双酶切的含有GST标签的pGEX-4T-2载体上,构建重组质粒pGEX-ATP1B1。　　 2、利用TNT体外转录翻译系统,将pGBKT7-UL136重组质粒作为捕获蛋白进行体外转录;提取在大肠杆菌中表达的pGEX-ATP1B1蛋白,作为诱饵蛋白将其固相化到MagneGSTMParticles上,按照MagneGSTTMPull-downSystem操作进行,将两种蛋白共同孵育,洗脱,纯化,Westernblot技术分析相互作用的蛋白复合物,ECL化学发光法鉴定结果,分析。　　 (三)激光共聚焦技术的细胞定位分析　　 1、将含有EeoR1和BamH1粘性末端的UL136基因片段,克隆到同时双酶切的含有绿色免疫荧光标记的pEGFP-C1载体上,构建重组质粒pEGFP-UL136;采用同样的方法将筛选得到的文库质粒克隆到含有红色免疫荧光标记的pDsRed-C1载体上,构建重组质粒pDsRed-ATP1B1。并测序分析验证。　　 2、培养人胚肾293T细胞。采用脂质体转染的方法,将pEGFP-UL136和pDsRed-ATP1B1共转染入293T细胞中,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白表达及定位情况。　　 结果：　　 一、酵母双杂交　　 1、用特异性引物成功扩增出HCMVUL136基因片段,片段长度为723bp并成功将其克隆到酵母系统的转录结合域pGBKT7载体上,命名为pGBKT7-UL136,测序分析显示结果与预期一致。测序结果表明融合区域的读码框正确,经测序证实为HCMVUL136序列且无碱基突变。　　 2、将pGBKT7-UL136重组质粒与人胎脑cDNA文库质粒共同转化入酵母细胞AH109中,经过重复筛选从SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板筛选出4个阳性克隆。　　 3、对验证后阳性克隆质粒测序和生物信息学分析共获得以下4个候选基因:VAT1,编码一种囊泡胺转运蛋白同系物;WDR1,编码色氨酸-天冬氨酸重复序列结构域;Cllorf17,能编码染色体11的开放读码框架17;ATP1B1,编码钠Na+/K+ATP酶的β亚基,其中筛选的阳性克隆与ATP1B1高度同源,同源性99%。　　 二、Pull-down技术鉴定　　 1、将文库质粒pACT2-ATP1B1,利用EcoR1和Xhol酶切,并同时确保读码框架正确,克隆到含有GST标签的pGEX-4T-2载体上,PCR鉴定,测序分析,克隆成功。　　 2、将重组质粒pGEX-ATP1B1转化入大肠杆菌BL21中,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,ATP1B1融合蛋白成功表达。　　 3、按照MagneGSTTMPull-downSystem操作,将含有c-Myc标签的pGBKT7-ULl36作为捕获蛋白,按照TNT体外转录系统成功体外转录;同时将pGEX-ATP1B1诱饵蛋白成功的固相化到MagneGSTTMParticles上,两种蛋白共同孵育,洗脱,纯化,通过抗c-Mye抗体进行Westernblot检测,结果发现两种蛋白在体外发生相互作用。　　 三、激光共聚焦显微镜技术进一步鉴定　　 1、采用EcoR1和BamH1限制性内切酶,构建重组质粒pEGFP-UL136和pDsRed-ATP1B1,PCR鉴定,测序分析显示克隆成功。　　 2、采用脂质体转染的方法,将上述两种重组质粒共同转染至生长状态良好的具有75%融合度的人胚肾293T细胞中,48小时后,通过共聚焦显微镜,利用488-nm波长和543-nm波长激光束观察蛋白分布,观察到HCMVUL136编码蛋白与ATP1B1编码蛋白共定位于细胞膜。　　 结论：　　 通过酵母双杂交,Pull-down和激光共聚焦实验确定HCMVLIL136蛋白和人胎脑文库蛋白ATP1B1发生相互作用,在活体细胞内看到两种蛋白共同定位于细胞膜。因此在HCMV感染过程中,LIL136编码蛋白通过与ATP1B1的相互作用,可能在维持细胞内渗透压和内环境稳态方面起了重要作用。