本文通过文献研究和实验研究两部分来探讨银杏内酯B(Ginkgolide B)抑制胶原(Collagen)、双氧水(H2O2)等诱导增龄机体血小板聚集的分子机制,对中医药防治老年人血栓形成机理有重要的临床意义和理论价值。文献研究1.中药银杏叶文献研究历来被誉为“活化石”银杏,为裸子植物,是银杏科银杏属的唯一生存种,其干燥叶子,被称为银杏叶。银杏叶用作药物首载于《本草品汇精要》,书中记载银杏叶“归肺经,能敛肺平喘,益心止痛”。从对历代文献的整理以及查阅中概括银杏叶的性味归经、功效主治等,为本课题提供了理论依据。2.中药银杏叶近代化学和药理研究中药银杏叶中含180多种化学成分,银杏叶提取物中主要有效成分为24%的黄酮甙(flavonoid glycosides)和6%的二萜内酯(terpenes)。黄酮类化合物主要具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用,而萜类化合物则为强效血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)受体拮抗剂,具有抑制血小板聚集,抗血栓等作用,其中以银杏内酯B对PAF受体的拮抗性最强,具有广泛的临床应用前景因而近几年备受关注。3.有关血栓形成的研究从分子生物学角度阐明血栓形成的始动环节及其发生机理,明确其信号传导通路中的若干重要环节,进而又针对地选取实验指标。4.有关增龄化对血栓形成影响的研究伴随年龄增长,心脑血管疾病发病率明显增加,心脑血管系统生理也发生一些改变,这些改变常常有助于血栓的形成。然而,增龄引起的生理功能改变的机制还有许多不明之处。从增龄机体血小板功能变化的特点着手,研究血栓形成的分子机制,是目前研究关注的热点问题。5.中医药对衰老与血栓形成的认识和研究从中医角度认识衰老与血栓形成的关系,从中医辨证论治的角度归纳血栓形成的症型、病机、治则,并对近几年用于治疗血栓的药物进行简单综述。6.银杏内酯B抗血栓作用的研究对近几年研究银杏内酯B用于治疗血栓的实验方法与目前的研究所得出的抗血栓作用机理进行简单综述。实验研究1.银杏内酯B对血小板功能的影响:方法:①用一氧化氮测定试剂盒,测定银杏内酯B对血小板一氧化氮产生的影响。②利用Western Blot方法,测定VASP(vasodilator-stimulated phosphoprotein)磷酸化水平以及NOX4(NADPH oxidase)表达。③用血小板聚集测定仪测定血小板聚集。④用流式细胞仪检测血小板内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量。结果①单独使用银杏内酯B(800μg/ml)显著增加血小板NO的含量,但低浓度银杏内酯B(200μg/ml)增加作用不明显。②Collagen刺激血小板后VASP磷酸化水平降低,而银杏内酯B预处理的血小板VASP磷酸化水平明显增加。③银杏内酯B以剂量依赖的方式抑制了ADP、Collagen和H2O2诱导的血小板聚集率并能延缓血小板聚集时间,但对AA诱导的血小板没有抑制作用。④活性氧测定表明银杏内酯B浓度依赖性地抑制H2O2诱导的ROS产生。⑤0.01% H2O2刺激血小板细胞使NOX4磷酸化水平增加,银杏内酯B(800μg/ml)有效抑制了H2O2诱导的NOX4磷酸化。