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茶树(Camellia sinensis)是我国重要的经济作物之一,其对低温胁迫较为敏感,因此提高茶树品种的抗寒性是目前茶树育种工作者面前艰巨而亟待解决的任务。植物microRNA (miRNA)是一类由发夹结构前体加工而成的长度约19-24个核苷酸的小分子内源性非编码单链RNA,通过介导靶基因的裂解或抑制靶基因的翻译调控基因的表达,在植物的生长、发育、分化、凋亡、新陈代谢、应激反应等方面起着重要的调控作用,具有高度的保守性、时序性和组织特异性。目前,尽管有一些关于茶树miRNA的研究报道,但所有这些都是基于生物信息学方法进行的预测和及其少量的传统克隆方法研究,而真正运用实验方法大规模地发掘茶树miRNA尚无相关报道。本研究以茶树抗寒品种‘迎霜’和低温敏感品种‘白叶1号’为试验材料,利用高通量测序、生物信息学分析、miRNA芯片、荧光定量PCR以及降解组测序技术系统研究茶树低温胁迫相关miRNA及其靶基因的识别、鉴定及差异表达分析,拓宽茶树抗寒性遗传基础,为茶树转基因栽培研究提供优良抗寒miRNA靶基因。本研究的主要结果如下：1.选用具有重要低温响应相关miRNA和miRNA靶基因的茶树品种资源‘迎霜’和‘白叶1号’,4℃模拟低温胁迫,分别于0、1、4、8、12、24和48 h七个不同时间点取茶树一芽二叶构建茶树低温胁迫小分子RNA混合文库。采用Solex深度测序技术挖掘茶树中低温相关的miRNA信息,总共获得了9700042条原始读序,3145122条独立的克隆序列。通过序列筛选获得序列长度为15-30 nt的小RNA片段其读数总量为2701149。将小RNA片段与Rfam、Genbank和Repeat-repbase数据库比对,去除其中的rRNA、tRNA、 snoRNA、snRNA和重复序列,对余下的小RNA序列进行分类筛选,获得了112条miRNA保守序列分属于27个不同的保守miRNA家族,其中53个miRNA与已知的miRNA完全匹配；通过前体发夹结构预测、碱基分布和MFEI指数特征分析获得111条候选的茶树新miRNA序列。2. 利用miRNA芯片从两个品种中分别筛选出172个差异表达的miRNA.其中,抗寒品种‘迎霜’中有34个miRNA上调表达,43个miRNA下调表达,而低温敏感品种‘白叶1号’中有50个miRNA上调表达,45个miRNA下调表达。在这些差异表达的miRNA中,miR168、miR529和miR2936在低温胁迫时所启动的miRNA响应途径存在一定程度的重叠,而miR164、miR408、 miR1511、miR5368、miR172、miR482、miR529和miR1160则在两个茶树品种中特异表达差异显著。通过荧光定量PCR对芯片杂交数据进行验证,所验证的11个miRNA探针序列中7条探针序列的荧光定量PCR结果与芯片杂交结果一致。3.利用降解组测序研究茶树低温胁迫下相关miRNA靶基因的作用模式。经高通量测序在+C Library中获得了6736820个长度为26 nt的mRNA降解序列,经过去除冗余后得到5376257个唯一的测序序列；在-C Library中获得了9224714个长度为26 nt的mRNA降解序列,经过去除冗余后得到7439589个唯一的测序序列。两个文库共鉴定了13个保守miRNA家族的靶基因514条,40个新miRNA靶基因249条,其中21个新miRNA为本研究鉴定到茶树新miRNA,19个测序获得的潜在新miRNA序列。这些靶基因可分为细胞组成、分子功能和生物过程三类,分别参与调节茶树的生长发育、转录调控、胁迫响应、信号转导、代谢途径等过程。对比两个文库的mRNA种类、数量与表达特征,构建了茶树低温胁迫下miRNA靶基因表达调控网络。综上所述,本研究第一次运用高通量测序的方法在茶树中验证了miRNA的存在,并发现了相当数量的miRNA及其靶基因。在全基因组范围内发现并筛选出茶树低温胁迫相关的miRNA,提供了充分的miRNA介导切割靶基因的数据。研究结果揭示了茶树抗寒miRNA的形成、作用机制、功能及其在低温胁迫基因调控网络中的作用,有利于丰富茶树抗寒机制理论知识,为深入开展茶树抗寒性研究提供新思路。