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靶标害虫抗性的产生是制约转Bt作物长期有效种植的重要因素之一,害虫抗性演化机制的研究是Bt研究方向中的一个热点。田间抗性演化机制较为复杂,同一昆虫个体内可能同时出现两个及以上基因的变异,然而大多数的研究着重于单个基因变异的Bt抗性,有关两个及以上基因共变异的Bt抗性研究甚少。本研究通过体外细胞试验、变异品系的构建、生物测定和生命表制作等多种方法对ABCC2、Cadherin基因单独变异以及共变异介导的Bt抗性进行了研究,并检测了田间棉铃虫种群ABCC2和Cadherin基因变异频率,主要研究结果如下: 1、棉铃虫ABCC2基因体外细胞试验结果显示,该基因表达的蛋白定位在细胞膜上,转入该基因的体外昆虫细胞在低浓度Cry1Ac处理下就出现细胞裂解,其EC50(使50%的转染细胞裂解的Cry1Ac浓度)为0.109μg/mL。生测结果显示,构建的棉铃虫ABCC2基因变异近等基因系(LFC2)对Cry1Ac的抗性倍数为512倍。LFC2在抗虫棉33B(Cry1Ac表达量为274.06±27.05ng/g)上的死亡率为27.33±5.00%,显著低于敏感品系的死亡率(46.00±5.29%);但是LFC2在抗虫棉33B上的死亡率和在常规棉中12上的死亡率(19.33±4.00%)没有显著差异,说明田间种植的转Cry1Ac单价抗虫棉不能有效防治该基因变异棉铃虫抗性种群。生命表结果显示,与敏感品系相比,LFC2各龄期幼虫(2-5龄)、雌蛹和雌雄成虫前期的发育历期均显著延长,成虫前期存活率显著降低,内禀增长率、周限增长率和净繁殖率显著降低,平均世代时间显著延长,而1龄幼虫和雄蛹的发育历期、雌雄成虫寿命、成虫产卵期和单雌产卵量没有显著差异。 2、棉铃虫Cadherin基因体外细胞试验结果显示,该基因表达的蛋白定位在细胞膜上,转入该基因的细胞对Cry1Ac的EC50为9.212μg/mL。生测结果显示,构建的Cadherin基因变异近等基因系(96CAD)对Cry1Ac的抗性倍数为396倍。96CAD在抗虫棉33B上的死亡率为27.44±1.28%,显著低于敏感品系的死亡率(46.00±5.29%);但是96CAD在抗虫棉33B上的死亡率仍然显著高于在常规棉中12上的死亡率(15.08±2.96%),说明虽然该基因变异能够介导棉铃虫对抗虫棉产生抗性,但是田间种植的转Cry1Ac单价抗虫棉对该类变异棉铃虫抗性种群仍有一定控制效果。生命表结果显示:与敏感品系相比,96CAD的2、4和5龄幼虫、雌蛹和雌雄成虫前期的发育历期均显著延长,成虫产卵期显著缩短,单雌产卵量显著减少,成虫前期存活率显著降低,内禀增长率、周限增长率和净繁殖率显著降低,平均世代时间显著延长,而1、3龄幼虫和雄蛹的发育历期以及雌雄成虫寿命没有显著差异。 3、棉铃虫ABCC2和Cadherin基因共转入体外细胞试验结果显示,共转入的细胞对Cry1Ac的EC50为0.017μg/mL,显著低于二者分别单独转入的细胞。生测结果显示:构建共变异品系(R1)对Cry1Ac的抗性倍数为6273倍。R1在抗虫棉33B上的死亡率为18.16±1.51%,显著低于敏感品系的死亡率(46.00±5.29%);但是R1在抗虫棉33B上的死亡率与在常规棉中12上的死亡率(14.33±2.33%)没有显著差异,说明田间种植的转Cry1Ac单价抗虫棉不能有效防治ABCC2和Cadherin基因共变异棉铃虫抗性种群。生命表结果显示,与敏感品系相比,R1的2、4和5龄幼虫、雌蛹和雌雄成虫前期的发育历期均显著延长,成虫前期存活率显著减低,内禀增长率和周限增长率显著降低,平均世代时间显著延长,1、3龄幼虫和雄蛹的发育历期、雌雄成虫寿命、成虫产卵期和净繁殖率没有显著差异,而单雌产卵量却显著增加。 4、2016-2018年,共测定了22个田间棉铃虫种群的Cry1Ac抗性水平,IC50在0.004μg/mL(银川种群,2017年)到0.403μg/mL(长岛种群,2017年)之间,在诊断剂量1.0μg/mL下的存活率为0到16.67%,2016年在该剂量下有存活个体的种群数为监测种群总数的60%,2018年上升为100%。在利用DNA分子技术检测的254个样品中,未发现ABCC2和Cadherin基因单独变异或共变异个体。 上述结果表明,棉铃虫ABCC2和Cadherin基因在介导Cry1Ac蛋白穿孔的过程中具有协同作用,而且这两个基因共变异在Bt抗性中具有“1+1>2”的协同抗性效应。ABCC2和Cadherin基因单独变异和共变异品系都表现出抗性适合度代价。棉铃虫田间种群对Cry1Ac的抗性水平显著升高,而ABCC2和Cadherin基因变异频率仍处于较低水平。